新风胶囊通过调控PPARγ/HMGCS2信号通路抑制佐剂性关节炎大鼠肺组织氧化应激

本研究发现中药复方新风胶囊（XFC）通过激活PPARγ信号通路，显著下调HMGCS2表达，降低NADPH氧化酶4（NOX4）和活性氧（ROS）水平，并提升超氧化物歧化酶（SOD）活性，从而有效抑制佐剂性关节炎（AA）大鼠肺组织炎症反应和氧化应激，改善肺功能参数（FVC、FEV0.2、PEF等）。该研究为类风湿关节炎相关肺损伤提供了新的治疗靶点和实验依据。

　　

背景

类风湿关节炎（RA）是一种复杂的自身免疫性疾病，全球患病率约0.5%-1%。随着疾病进展，多数患者会出现关节外组织器官病变，其中肺部是最常受累的器官之一，可表现为间质性肺病变、类风湿结节和胸膜炎等。间质性肺病（ILD）是RA患者最常见的肺部并发症，发生率在1.8%-67%之间，严重影响患者生活质量并带来沉重社会经济负担。RA相关肺损伤早期缺乏明显临床症状，主要表现为肺功能进行性下降，这种隐匿性起病常常导致识别不足和干预延迟。目前其发病机制尚未完全阐明，治疗手段有限。

过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）信号通路是调节炎症、氧化应激和纤维化的关键通路，这些过程都是肺损伤的核心病理过程。PPARγ激活在各种肺病模型中发挥抗炎和抗纤维化作用。3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶2（HMGCS2）是酮体生成过程中的关键酶，最近被确定为PPARγ信号调控的下游靶点。PPARγ/HMGCS2轴失调在肺外组织中促进氧化应激和细胞损伤，但其在RA相关肺损伤中的具体作用和治疗潜力尚未明确。

新风胶囊（XFC）是一种传统中药复方制剂，由黄芪、薏苡仁、雷公藤和蜈蚣按20:20:10:1的比例组成，已在中国注册（安徽药制字Z20050062）并获得国家发明专利（ZL201310011369.8）。前期大规模、多中心、随机、双盲临床试验表明，XFC能显著缓解RA患者关节症状并改善肺功能。动物实验显示XFC改善佐剂性关节炎（AA）大鼠肺损伤，细胞实验表明其能抑制肺成纤维细胞增殖，但其潜在分子机制，特别是PPARγ/HMGCS2通路的参与尚不清楚。

方法

研究采用液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析XFC化学成分，通过串联质谱标签（TMT）标记对大鼠肺组织差异表达蛋白（DEPs）进行蛋白质组学和生物信息学分析。使用弗氏完全佐剂建立AA大鼠模型，观察滑膜和肺组织病理变化及肺功能改变。同时，用转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导肺成纤维细胞构建细胞模型，研究含XFC血清通过PPARγ/HMGCS2通路对氧化应激和肺纤维化的影响。

XFC提取物制备采用甲醇超声提取法，LC-MS分析使用Thermo Vanquish超高效液相色谱系统，配备ACQUITY UPLC^? HSS T3色谱柱（2.1×150 mm，1.8 μm），流动相为乙腈和含0.1%甲酸的水，梯度洗脱，流速0.25 mL/min。质谱分析采用电喷雾离子源（ESI），正负离子模式采集。

动物实验使用36只Sprague-Dawley（SD）大鼠，随机分为对照组、AA模型组、XFC治疗组（高、低剂量）和来氟米特（LEF）阳性对照组。AA模型建立后开始治疗，XFC组灌胃给予0.068 g/mL（高剂量）和0.017 g/mL（低剂量）混悬液，LEF组给予0.095 mg/mL混悬液，AA组给予0.9%生理盐水。所有组别每天下午2点灌胃给药1 mL/100 g体重，持续4周。

肺功能评估使用动物肺功能仪，支气管肺泡灌洗液收集后离心，上清液保存于-80°C。肺组织和关节滑膜组织进行苏木精-伊红（H&E）和Masson染色，病理变化在光学显微镜下观察。蛋白质组学分析采用BCA法测定蛋白浓度，FASP酶解法处理样品，TMTpro试剂标记，液相色谱分离后使用Q Exactive HF质谱仪分析。

细胞实验使用HFL-1肺成纤维细胞，用50 ng/mL TGF-β1诱导建立细胞模型，随后用不同浓度含XFC血清（10%、20%、40%）处理24、48和72小时。细胞活力采用CCK-8法检测。为研究PPARγ在TGF-β1诱导的氧化应激中的作用，细胞用罗格列酮（RSG，10 μmol/L）或GW9662（PPARγ拮抗剂，5 μmol/L）处理。

酶联免疫吸附测定（ELISA）检测支气管肺泡灌洗液和细胞上清液中IL-1β、TNF-α和IL-6水平。流式细胞术（FCM）检测细胞内活性氧（ROS）水平，使用2′,7′-二氯荧光素二乙酸盐染色。Western blotting检测肺组织中Fabp5、Pltp、Me1和β-actin蛋白表达。定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）检测胶原类型Iα1（COL1A1）和胶原类型IIIα1（COL3A1）mRNA表达。免疫荧光（IF）和免疫组化检测PPARα、PPARγ、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、HMGCS2和NADPH氧化酶4（NOX4）表达。

结果

LC-MS分析共鉴定出XFC中867种化合物，其中25种独特化合物与肺纤维化和肺损伤密切相关，包括槲皮素、香豆素、芒柄花苷、黄芪甲苷、黄芪苷A、大豆甙元A、表儿茶素、蛇菰宁和山奈酚等。

动物实验显示，FCA注射后第2天大鼠可见趾部肿胀，第7天成功建立AA模型。与对照组相比，AA组大鼠爪体积和关节炎评分显著增加，在第21天达到峰值。从FCA注射后第14天开始，AA大鼠接受不同剂量XFC或LEF治疗干预。与AA组相比，LEF和高剂量XFC从第14天开始显著减轻爪肿胀和关节炎评分，低剂量XFC也从第21天开始显示显著改善。LEF治疗组和高剂量XFC组之间无统计学差异。关节滑膜组织病理学分析显示，AA大鼠出现明显滑膜增生和大量炎性细胞浸润。XFC或LEF治疗减少了滑膜增生和炎症浸润，其中高剂量XFC显示出比低剂量XFC更强的治疗效果。

肺组织评估表明，与AA组相比，高剂量XFC和LEF治疗显著减少肺组织炎性细胞浸润和胶原沉积，肺泡结构改善，表现为结构更规则、肺泡腔扩大和间隔变薄。高剂量XFC和LEF组之间无显著差异，而低剂量XFC治疗未显著改善病理变化。高剂量XFC和LEF还显著降低纤维化标志物（α-SMA、COL1A1和COL3A1）表达，并降低支气管肺泡灌洗液中炎性细胞因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）水平。肺功能参数包括用力肺活量（FVC）、0.2秒用力呼气量（FEV_0.2）、FEV_0.2/FVC、峰值呼气流速（PEF）和50%用力呼气流速（FEF₅₀）在高剂量XFC和LEF治疗组均显著改善。

蛋白质组学分析共鉴定出7214种蛋白质，其中5680种符合定量分析标准。使用|log₂FC|>1和P<0.05的阈值，在XFC治疗组与AA组之间鉴定出61个DEPs，其中25个蛋白上调，36个蛋白下调。前5个上调的DEPs为Tpm3、Cnn1、Hdhd3、Phrf1和Ist1，前5个下调的DEPs为Nup43、HMGCS2、Aaas、Fhip2a和Cul2。

GO分析显示，在生物过程（BP）中，细胞对ROS的反应、细胞对氧化应激的反应、细胞对化学应激的反应、粒细胞迁移、髓系白细胞迁移、粒细胞趋化性、巨噬细胞增殖、单核细胞迁移和粒细胞趋化性调节发生显著变化。在细胞组分（CC）中，黏着斑、细胞-基质连接、黑色素体、色素颗粒、小窝、膜胞质侧、基底质膜、质膜胞质侧外成分和核膜检测到显著变化。在分子功能（MF）中，最受影响的功能类别包括磷酸化氨基酸结合蛋白、磷蛋白结合、磷酸酪氨酸残基结合、以NAD或NADP为受体的醛或氧代基团氧化还原酶活性、磷酸酶结合、抗氧化活性、核苷三磷酸酶调节活性、细胞黏附分子结合和I型转化生长因子β受体结合。

KEGG通路分析显示，最显著改变的通路包括代谢通路、PPAR信号通路、HIF-1信号通路、化学致癌-ROS、丙酮酸代谢、糖酵解/糖异生和黏着斑。其中，与氧化应激密切相关的PPAR信号通路富集了5个蛋白：HMGCS2、Me1、Fabp5、Pltp和Apoc3，HMGCS2是下调最显著的DEP。PPI分析确定HMGCS2和Apoc3是与氧化应激反应相关的枢纽蛋白。

机制研究表明，与AA组相比，XFC组PPARγ蛋白表达显著增加，而PPARα水平无显著差异，表明XFC可能通过PPARγ而非PPARα激活PPAR信号通路。此外，XFC组HMGCS2、Me1、Fabp5、NOX4和SOD蛋白水平显著降低，表明XFC减少肺组织氧化剂积累的同时增强肺抗氧化能力。

细胞实验证实，TGF-β1刺激后，HFL-1细胞PPARγ蛋白水平显著降低，而HMGCS2、ROS、NOX4、α-SMA、COL1A1、COL3A1、TNF-α和IL-6水平显著升高。PPARγ激动剂RSG（10 μmol/L，48小时）上调PPARγ蛋白表达，同时降低HMGCS2、ROS、NOX4、α-SMA、COL1A1、COL3A1、TNF-α和IL-6水平。GW9662（5 μmol/L）和含XFC血清共处理48小时显示，含XFC血清能抵消GW9662的促炎和氧化作用，恢复PPARγ蛋白表达并降低HMGCS2、ROS、NOX4、α-SMA、COL1A1、COL3A1、TNF-α和IL-6表达。含XFC血清与RSG具有相似功能。

讨论

RA是一种慢性全身性自身免疫性疾病，虽然主要与关节破坏相关，但常伴有关节外表现，其中肺部并发症尤其常见和严重。流行病学研究表明，约70%的RA患者表现出某种形式的肺部受累，ILD是最普遍和严重的并发症之一，发生率高达47%。早期RA-ILD可能表现为肺泡炎，晚期可进展为间质纤维化，是预后不良和死亡率增加的主要原因。早期诊断和及时干预至关重要，但常常被延迟或忽视。

当前RA-ILD的药物治疗包括糖皮质激素、免疫抑制剂、细胞毒药物、抗纤维化疗法和新型生物制剂。然而，长期使用糖皮质激素和免疫抑制剂会带来显著不良反应，包括胃肠道、肝和肾毒性以及耐药性发展。此外，抗纤维化和靶向治疗成本高昂，疗效不一，带来沉重经济负担。这些局限凸显了对更安全、有效和经济治疗方案的未满足临床需求。

近年来，中药作为RA-ILD的潜在治疗方法受到越来越多关注。与单靶点合成药物不同，中药配方通常由多种活性化合物组成，通过多种机制发挥作用，在治疗多因素疾病如RA-ILD方面具有潜在优势。

根据中医理论，RA相关肺损伤归因于脾虚导致痰瘀积于肺，表现为炎症和纤维化。基于这一原理，研发了新风胶囊配方。XFC是一种多草药中药处方，在过去二十年中得到了广泛研究。临床和基础研究均提供证据支持其改善RA诱导的肺损伤的功效。

本研究采用LC-MS基于非靶向代谢组学和TMT基于蛋白质组学测序研究XFC在AA大鼠模型中治疗RA相关肺损伤的机制。植物化学分析显示，XFC醇提取物含有黄酮类、黄酮醇类、异黄酮类、脂肪酸类、生物碱类、苯并二氮卓类和其他化合物。 notable high-abundance constituents include quercetin, caffeic acid, astragalosides, kaempferol, formononetin, betaine, epicatechin, ononin, luteolin, berberine, and celastrol，其中许多以其抗炎、抗氧化、抗纤维化和肺保护特性而闻名。黄芪甲苷和雷公藤红素特别值得关注，已被证实在AA模型中发挥抗炎和免疫调节作用。这些发现表明XFC的药理活性由多种化合物共同介导，而非依赖单一化合物。

蛋白质组学分析发现HMGCS2显著下调，GO和KEGG富集分析表明最受影响的BP和通路包括细胞对ROS的反应、细胞对氧化应激的反应和PPAR信号通路。PPI网络分析进一步确定HMGCS2和Apoc3为枢纽蛋白，表明它们在XFC治疗机制中的核心作用。

氧化应激是炎症反应和急性/慢性肺损伤的关键驱动因素。肺损伤后，募集的炎症细胞和结构细胞（如上皮细胞和成纤维细胞）产生内源性ROS，从而导致组织破坏。线粒体呼吸和NOX4是ROS的主要来源。NOX4在纤维化期间肺成纤维细胞中表达升高，其敲低可改善小鼠博来霉素诱导的纤维化。SOD是关键抗氧化酶，可减轻氧化损伤。

过氧化物酶体增殖物激活受体是配体激活的核激素受体，调节多种生理过程。存在三种亚型：PPARα、PPARγ和PPARβ/δ。PPARα在支气管上皮、肺泡壁和巨噬细胞中表达。相比之下，PPARγ在肺成纤维细胞、气道上皮细胞、II型肺细胞、巨噬细胞、T细胞和平滑肌细胞中广泛表达。PPARβ/δ未在肺细胞中检测到。PPARγ可被合成配体如RSG或吡格列酮激活，发挥抗炎、抗纤维化和细胞保护作用。PPARγ激活抑制TGF-β诱导的纤维化反应，并抑制气道上皮细胞中促炎细胞因子（如IL-6、IL-1β和TNF-α）的释放。在博来霉素诱导的肺纤维化模型中，PPARγ激动剂可减轻体重减轻、改善组织病理学结果并提高存活率。它们还调节成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，并减少哮喘模型中的气道重塑。此外，PPARγ通过PPAR反应元件增强SOD表达，促进抗氧化防御。

HMGCS2催化乙酰辅酶A和乙酰乙酰辅酶A缩合形成HMG-CoA，这是酮体生成中的关键不可逆步骤。多种转录因子调节其表达。PPARγ已被证明在高脂血症诱导的心肌细胞和结肠癌细胞中调节HMGCS2。HMGCS2通过增强PPARα介导的Src转录活性促进细胞侵袭和转移。此外，PPARα/HMGCS2信号可能诱导铁死亡。研究表明HMGCS2过表达促进ROS积累和线粒体膜电位损失，从而诱导糖尿病心肌病。相反，沉默HMGCS2通过增强细胞活力、抑制凋亡、抑制炎症反应和减少氧化应激来减轻高糖诱导的糖尿病心肌病。此外，PPARγ作为HMGCS2的上游调节因子：PPARγ激活抑制HMGCS2表达，而PPARγ抑制升高其表达。

本研究发现XFC激活PPARγ信号，导致HMGCS2下调，氧化应激减少，炎症和纤维化反应减弱。该机制与合成PPARγ激动剂如RSG的研究一致，RSG在肺纤维化临床前模型中显示疗效。然而，合成PPARγ激动剂的临床应用受到全身副作用限制，包括体重增加、液体潴留和心血管风险。相比之下，XFC以其多组分组成，可能提供更有利的效益-风险特征。尽管XFC和RSG共享PPARγ激活作为共同机制，但LC-MS分析表明XFC提供多种生物活性化合物（如黄芪甲苷IV、槲皮素、山奈酚和雷公藤内酯）的组合，具有互补的抗炎、抗氧化和免疫调节特性。XFC不是直接强力激活PPARγ，而是以更平衡和组织特异性方式调节该通路，同时参与额外的抗纤维化和抗炎通路。这种多靶点策略是中药的特征，可能为复杂疾病如RA相关肺损伤提供更全面和可持续的治疗方法。

值得注意的是，刘教授提出的中医理论——RA相关肺损伤源于脾虚导致痰瘀积聚——与我们的分子发现密切吻合。在中医中，脾主运化；其功能障碍意味着代谢失调。XFC减少氧化应激（通过降低NOX4和ROS）和增强抗氧化能力（通过增加SOD）可解释为纠正脾虚和消除病理性痰瘀。“痰”和“瘀”的现代相关物——即炎症浸润、细胞因子释放和胶原沉积——被XFC治疗一致减少。因此，PPARγ激活作为中医理论与当代病理生理学之间的机制桥梁。通过激活PPARγ和正常化HMGCS2介导的代谢 dysfunction，XFC解决了脾虚的核心中医证候及其病理后果（炎症/纤维化）。

结论

本研究证实XFC上调PPARγ表达，下调HMGCS2，并降低氧化应激标志物（NOX4、ROS）以及纤维化指标在AA大鼠肺中。此外，使用肺成纤维细胞模型，我们证明XFC通过PPARγ介导的炎症和氧化应激抑制来抑制纤维化。这些发现不仅为XFC在预防和治疗RA相关肺损伤方面的潜力提供了实验证据，而且为解决RA相关间质肺纤维化提供了新的分子靶点和通路。