滋阴补阳方调控lncRNA TCONS_00265853-miR-421-5p-CLOCK轴改善昼夜节律紊乱型多囊卵巢综合征的作用机制研究

本研究通过生物信息学与实验验证相结合的方法，揭示昼夜节律紊乱通过lncRNA TCONS_00265853-miR-421-5p-CLOCK轴激活MAPK信号通路（p-p38/p-ERK1/2/p-JNK），导致卵巢细胞凋亡（↑BAX/↓Bcl-2）及内分泌紊乱（↓E2/FSH；↑LH/T/ACTH）。滋阴补阳方（ZYBYF）可逆转该轴异常表达，抑制MAPK磷酸化，恢复卵巢功能与激素平衡，为中医药治疗PCOS提供新靶点。

　　

背景

多囊卵巢综合征（PCOS）是育龄期女性最常见的内分泌疾病之一，发病率高达5%-18%，以高雄激素血症和卵泡发育障碍为主要特征。其发病机制涉及遗传、表观遗传及环境因素等多重因素，其中昼夜节律紊乱与PCOS的关联近年来备受关注。昼夜节律调控系统参与女性生殖功能的多个环节，包括卵泡成熟、排卵、受精、胚胎植入和分娩过程。时钟基因（clock genes）的异常表达与月经失调、不孕和流产密切相关，但在PCOS中的具体机制尚未明确。

长链非编码RNA（lncRNA）和微RNA（miRNA）被证实是调控昼夜节律和PCOS的关键分子。本研究团队前期转录组数据显示，在昼夜节律紊乱的卵巢组织中，lncRNA TCONS_00265853是显著下调的转录本之一，其可能通过结合miR-421-5p调控下游靶基因CLOCK的表达。基于中医理论，肾脏与生殖健康密切相关，滋阴补阳方（ZYBYF）由滋方（ZYF）和补阳方（BYF）组成，遵循月经周期中"经后期滋肾阴，经前期温肾阳"的治疗原则，在临床实践中显示出对PCOS的良好疗效。

材料与方法

通过网络药理学方法，从TCMSP数据库及相关文献中筛选ZYBYF的活性成分（OB≥30%，DL≥0.18），最终获得ZYF成分40种、BYF成分66种，对应作用靶点261个。PCOS相关靶点从GeneCards、DrugBank、DisGeNET和PharmGKB数据库收集，经去重后得到5434个基因。通过连续光照诱导的PCOS大鼠模型获取卵巢组织转录组数据，鉴定出1150个人类同源差异表达基因（DEGs）。Venn图分析显示三者交集靶基因为25个。

采用GO和KEGG富集分析对交集基因进行功能注释，使用STRING数据库构建蛋白质相互作用网络（PPI）。动物实验采用SPF级雌性SD大鼠，分为正常光暗周期组（D/L）、连续光照组（L/L）和ZYBYF治疗组。连续光照（500±20 lux）持续10周诱导PCOS模型，ZYBYF干预方式为发情前期和发情期给予ZYF（5.88 mg/kg），发情后期和间情期给予BYF（6.195 mg/kg）。

通过HE染色观察卵巢形态学变化，ELISA法检测血清AMH、E2、LH、FSH、T和ACTH水平，Western blot检测p-p38、p-ERK1/2、p-JNK、BAX、Bcl-2和CLOCK蛋白表达，RT-qPCR检测lncRNA TCONS_00265853、miR-421-5p和CLOCK mRNA表达，TUNEL染色评估卵巢细胞凋亡情况。

结果

靶点筛选与通路富集

生物信息学分析发现25个交集基因，GO功能富集显示这些基因主要参与蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性调节等生物过程，KEGG通路分析表明MAPK信号通路是最显著富集的通路之一。PPI网络预测显示CLOCK与MAPK通路中的PRKCA、IL1B、ERBB2、KDR、VEGFA和TGFB1等基因存在相互作用。

动物模型验证

连续光照10周后，大鼠动情周期紊乱，体重降低，卵巢重量和卵巢指数增加，卵巢出现多囊样改变：囊状卵泡增多，颗粒细胞层变薄。血清激素检测显示AMH、LH、T和ACTH水平显著升高（p < 0.001），E2和FSH水平降低（p < 0.001），成功建立PCOS模型。ZYBYF治疗后这些指标均得到明显改善。

分子机制探索

在连续光照组中，lncRNA TCONS_00265853和CLOCK表达下调，miR-421-5p表达上调（p < 0.001）。MAPK通路相关基因表达异常：Prkca mRNA表达降低，Il1b、Vegfa、Kdr、Erbb2和Tgfb1表达升高。Western blot结果显示p-p38、p-ERK1/2和p-JNK蛋白磷酸化水平显著增加（p < 0.001）。同时，促凋亡蛋白BAX表达上升，抗凋亡蛋白Bcl-2表达下降，TUNEL染色显示卵巢细胞凋亡率显著增加（p < 0.001）。

ZYBYF干预后，lncRNA TCONS_00265853和CLOCK表达回升，miR-421-5p表达下降。Prkca mRNA表达恢复正常，其他五个基因表达回落。MAPK通路磷酸化水平（p-p38、p-ERK1/2、p-JNK）显著降低，BAX/Bcl-2比值改善，卵巢细胞凋亡率下降。

讨论

本研究首次整合生物信息学与实验验证方法，系统阐述了昼夜节律紊乱通过lncRNA TCONS_00265853-miR-421-5p-CLOCK轴促进PCOS发生的分子机制。研究发现PRKCA是该通路中的关键调节因子，其表达受CLOCK调控，进而影响MAPK信号通路的活性。MAPK通路的过度激活导致卵巢颗粒细胞过度凋亡，破坏卵泡正常发育，最终引起内分泌紊乱和PCOS表型。

ZYBYF作为传统中药复方，通过多成分、多靶点的作用特点，有效逆转了昼夜节律紊乱引起的分子异常。其作用机制包括：上调lncRNA TCONS_00265853表达，抑制miR-421-5p活性，恢复CLOCK表达水平，进而通过PRKCA调控MAPK通路活性，抑制卵巢细胞凋亡，改善激素水平紊乱。

研究中发现的六个关键基因（PRKCA、IL1B、ERBB2、KDR、VEGFA和TGFB1）均为PCOS相关的重要调控因子，与既往研究结果一致。这些基因涉及炎症反应、血管生成、细胞增殖和分化等多个生物学过程，共同构成了PCOS发病的复杂网络。

结论

昼夜节律紊乱通过lncRNA TCONS_00265853-miR-421-5p-CLOCK轴导致PRKCA表达下调，引起MAPK信号通路过度激活（p-p38、p-ERK1/2、p-JNK磷酸化水平升高），促进卵巢细胞凋亡（BAX/Bcl-2比值失衡），最终诱发或加重PCOS。滋阴补阳方（ZYBYF）能够有效逆转这一病理过程，恢复卵巢功能和内分泌平衡，为临床治疗昼夜节律紊乱相关PCOS提供了新的治疗策略和理论依据。建议PCOS高危人群和患者避免熬夜和夜间工作，保持规律作息，结合中医药治疗可能获得更好的疗效。