沙地云杉体细胞胚胎发生的PacBio长读长转录组测序分析及PmBBM基因功能表征

本推荐聚焦沙地云杉（Picea mongolica）体细胞胚胎发生（SE）的分子机制研究。研究采用PacBio单分子实时（SMRT）长读长测序技术，成功构建了首个高质量的参考转录组数据库，系统鉴定了选择性剪接（AS）、简单序列重复（SSR）、长链非编码RNA（lncRNA）及转录因子（TF）等关键元件。研究成功克隆并解析了关键基因PmBBM（属AP2/ERF超家族）的序列特征、亚细胞定位及表达模式，揭示了其在SE过程中的动态调控作用。该成果为这一濒危树种的保育（germplasm preservation）和分子育种（molecular breeding）提供了宝贵的遗传资源（genomic resources）和理论依据。

　　

1 Introduction

沙地云杉（Picea mongolica）是中国特有的珍稀濒危常绿针叶树种，隶属于松科（Pinaceae），仅分布于内蒙古浑善达克沙地东南部地区。其木材广泛应用于造纸和家具生产，树皮可作为松节油的来源。这种具有重要生态和经济价值的物种表现出非凡的适应性，包括耐沙埋、抗寒和耐旱特性。由于自然更新率低、幼苗死亡率高、种子产量有限且易受病虫害侵袭，沙地云杉的种群资源持续下降。为解决这些保护挑战，体细胞胚胎发生（Somatic Embryogenesis, SE）等生物技术方法为大规模克隆繁殖、种质保存和遗传改良提供了一条有前景的途径。然而，沙地云杉的SE方案仍然低效且不可靠，这主要是由于对该过程分子调控机制的理解完全缺乏。因此，识别控制SE的关键基因和调控网络是克服这些技术障碍的关键先决条件。

早期对沙地云杉的研究主要集中在育苗、造林技术、引种栽培及其生理生化特性。最近，分子生物学研究的数量有所增加。对不同发育阶段合子胚的转录组研究揭示了阶段特异性差异基因表达模式，其中最显著的差异发生在早期胚胎发生和胚胎成熟阶段。包括MYB、WRKY、WOX、AP2、GATA和TCP在内的转录因子家族在不同胚胎发育阶段表现出不同的表达谱。对非胚性愈伤组织（NEC）和胚性愈伤组织（EC）的转录组比较鉴定出13,267个差异表达基因，证明植物激素相关、应激反应和信号转导基因共同调控沙地云杉的胚性能力。为解决体细胞胚萌发过程中根伸长和侧根形成的挑战，采用单细胞转录组学来表征侧根发育过程中的细胞类型和特异性表达模式，阐明细胞进化轨迹并构建分子调控网络。

SE是一种有效的体外再生系统，是遗传转化的理想受体，具有巨大的生物技术潜力。大量研究已证实，植物SE受由植物激素（包括生长素、脱落酸和细胞分裂素）控制的复杂基因网络调控。BABY BOOM (BBM) 基因是AP2/ERF超家族中AP2亚家族的成员，在植物生长调控和应激反应中起着至关重要的作用。BBM最初从欧洲油菜（Brassica napus）未成熟花粉粒中分离出来。BBM的异位表达不仅促进欧洲油菜和拟南芥（Arabidopsis thaliana）的细胞增殖和形态发生，而且能在不施用外源激素的情况下成功诱导SE。在落叶松（Larix kaempferi × L. olgensis）中，BBM在不定根发育中发挥调控作用。在玉米（Zea mays）中，BBM促进胚胎再生，从而影响转化效率。在犬蔷薇（Rosa canina）中，RcBBM过表达促进叶和根外植体的芽再生。积累的证据已证实BBM在SE诱导、增强细胞增殖和再生、提高遗传转化效率和诱导无融合生殖等多方面功能，确立了BBM作为胚胎特异性基因和胚性能力的标志物。鉴于AP2转录因子，特别是BBM，作为细胞多能性和SE的主要调节因子的公认保守作用，以及它们在初步转录组数据中的显著代表性，我们随后的分析重点聚焦于该家族。

虽然先前关于沙地云杉SE的转录组研究描述了发育阶段的基因表达特征，但仍然缺乏全面的长读长转录本异构体目录，这对于准确的基因注释、选择性剪接分析和lncRNA识别至关重要。因此，本研究的主要目的是利用PacBio SMRT测序为沙地云杉建立参考质量的长读长转录组。为实现这一目标，采用混合样本策略以最大化捕获用于异构体发现的转录本多样性。基于这一基础资源，我们进一步寻求克隆和表征关键的SE相关基因PmBBM并分析其表达模式，从而阐明其调控作用。我们的最终目标是确定优化SE方案的遗传靶点，从而促进这种濒危针叶树的保护和可持续利用。

2 Materials and methods

2.1 Plant materials

沙地云杉的未成熟种子采集自内蒙古赤峰市克什克腾旗的白音敖包自然保护区。以未成熟的合子胚作为外植体诱导沙地云杉的SE，遵循本研究小组建立的方案。收集了非胚性愈伤组织（NEC）、胚性愈伤组织（EC）、球形胚（GSE）、晚期胚（LSE）、成熟胚（MSE）和体细胞胚苗（EP）的样本。样本收集后立即在液氮中冷冻，随后保存在-80°C。

2.2 RNA extraction, library construction, and sequencing

使用TRIzol试剂通过研磨组织提取总RNA。使用Agilent 2100 Bioanalyzer和琼脂糖凝胶电泳测定RNA完整性。使用Nanodrop微量分光光度计测定RNA的纯度和浓度。使用专门为PacBio Iso-Seq文库制备设计的Clontech SMARTer PCR cDNA Synthesis Kit从poly(A)+ RNA合成cDNA。所得的双链cDNA进行PCR扩增。按照标准Iso-Seq方案构建SMRTbell模板文库，包括DNA损伤修复、末端修复和接头连接。将SMRTbell模板与测序引物退火，与聚合酶结合，并在PacBio Sequel II平台上进行测序。

2.3 Data processing

使用SMRT Link V8.0.0分析来自cDNA文库的原始测序读数。从subread BAM文件中提取高质量的环状共识序列（CCS）。去除引物、条形码、poly A尾和完整通过的串联体，获得全长非嵌合（FLNC）读数。使用minimap2对相似的FLNC读数进行分层聚类以获得一致性序列。然后使用quiver算法进一步校正一致性序列。基于结果，使用高质量异构体（预测准确度≥0.99）进行后续分析。

将异构体通过BLASTx程序与NCBI非冗余蛋白（Nr）数据库、Swiss-Prot蛋白数据库、京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库和直系同源基因簇/真核生物直系同源群（COG/KOG）数据库进行比对分析。使用Blast2GO软件和异构体的Nr注释结果分析与其他物种基因的序列相似性基因本体（GO）注释。

使用MISA进行简单序列重复（SSR）分析，随后对在四个主要数据库中未注释的长读长转录本进行lncRNA鉴定。使用CNCI和CPC严格评估编码潜力，只有被两种工具一致预测为非编码的转录本才被视为可靠的lncRNA。使用Cogent软件组装编码序列，作为使用SUPPA进行选择性剪接（AS）分析的参考。最后，将预测的蛋白质序列针对PlantTFDB数据库进行hmmScan，以识别和量化转录因子（TF）。

2.4 Cloning of the PmBBM gene and bioinformatics analysis

利用长读长转录组数据，我们预测了PmBBM基因（Isoform0001869）的CDS。设计基因特异性引物PmBBM-F和PmBBM-R进行PCR扩增，随后进行电泳、凝胶回收、T载体连接并转化至大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α感受态细胞。将重组质粒送至Tsingke Biotechnology进行测序。

使用DNAMAN软件翻译相应的氨基酸序列。使用在线工具ProtParam分析PmBBM蛋白的理化性质。使用DeepTMHMM预测跨膜结构域，并使用ProtScale进行疏水性分析。使用SignalP-6.0进行信号肽预测。分别使用SOPMA和SWISS-MODEL预测PmBBM的二级和三级结构。使用NetPhos预测磷酸化位点，并使用NCBI分析保守结构域。从NCBI数据库获得PmBBM的同源氨基酸序列。使用DNAMAN进行多序列比对。使用MEGA6构建系统发育树。

2.5 Subcellular localization

通过将PmBBM连接到pBWA(V)H2STMVΩ-3×flag-ccdB-egfp创建过表达载体pBWA(V)H2STMVΩ-3×flag-BBM。将过表达载体转化至DH5α受体细胞。通过菌落PCR鉴定阳性克隆并进行测序以进一步鉴定。将正确的质粒转化至农杆菌GV3101感受态细胞中进行检测，使用pBWA(V)H2STMVΩ-3×flag-ccdB-egfp作为阴性对照，选择阳性克隆并扩繁，制备农杆菌侵染液，将OD600调整至约0.60。用注射器注射烟草叶片下表皮，黑暗培养48小时，并在共聚焦激光显微镜下观察和拍照。

2.6 Analysis of the expression patterns of the PmBBM and AP2 transcription factor family

利用我们团队现有的NEC、EC、GSE、LSE、MSE和EP发育阶段的转录组数据，我们系统地检查了PmBBM和AP2家族基因在整个六个发育阶段的表达谱。使用OmicSmart通过热图分析可视化基因表达模式。

3 Results

3.1 Overview of long-read transcript sequencing data

使用SMART测序获得33.88 Gb的测序数据，包含15,586,833条subreads，平均长度为2,173 bp，N50为2,350 bp。过滤Full Passes ≥1的subreads后，获得220,241条高精度CCS读数，总计510,826,820个碱基，平均长度为2,319 bp，平均Full Pass数为42。对这些CCS读数进行分类，得到112,449条FLNC序列（51.06%），平均长度为2,320.79 bp，1,441条全长嵌合序列（0.65%）和106,351条非全长读数（48.29%）。对FLNC读数进行分层聚类生成一致性序列，随后使用Quiver算法进行抛光，产生14,823条高质量和36条低质量序列。去除冗余后，我们获得12,232条长读长转录本异构体，平均长度为2,331.98 bp，N50为2,486 bp，读长主要分布在1000–4000 bp之间。

3.2 Classification and functional annotation

比较分析显示，12,092条（98.86%）长读长转录本在KEGG、KOG、Nr和Swiss-Prot数据库中成功注释。具体而言，11,895条（97.24%）转录本在KEGG中注释，8,444条（69.03%）在KOG中注释，12,092条（98.86%）在Nr中注释，10,751条（87.89%）在Swiss-Prot中注释，而140条（1.14%）转录本仍未注释。值得注意的是，8,151条转录本同时在所有四个数据库中注释。

从Nr数据库注释的12,092条转录本与253个物种进行了比较。显示了同源序列数量排名前10的物种。其中，与北美云杉（Picea sitchensis）和南方红豆杉（Taxus chinensis）相比对的基因数量最多，分别为5,099和3,597条。其次是林仙（Amborella trichopoda）、莲（Nelumbo nucifera）和延药睡莲（Nymphaea colorata）等植物。在转录本中，与沙地云杉最相似的物种是北美云杉。

北美云杉分布于北美太平洋沿岸，而沙地云杉是中国内蒙古浑善达克沙地的特有种。尽管它们地理分布遥远，但分子系统发育研究表明，来自北美西部的云杉物种和来自东亚的云杉物种形成了一个密切相关的进化枝。这些物种共享一个相对较近的共同祖先，这解释了它们基因组中观察到的高度序列相似性。相比之下，欧洲主要的云杉物种欧洲云杉（Picea abies）属于一个不同的进化谱系。它更早地从东亚-北美进化枝中分化出来，长期的独立进化导致基因组差异的更大积累，导致直系同源基因的序列相似性降低。因此，仅鉴定出107个高度相似的转录本。尽管欧洲云杉是目前云杉属中唯一发表参考基因组的物种，但初始基因组组装的完整性和注释质量相对较低，从而限制了其作为沙地云杉等系统发育遥远物种的参考效用。

3.3 GO and KOG annotation

功能注释分析成功将10,564条转录本分配到GO类别，这些类别分为三个主要领域的48个功能组：生物过程、细胞组件和分子功能。在生物过程领域内，细胞过程（8,347）、代谢过程（7,462）和对刺激的反应（3,089）是最丰富的类别。细胞组件领域以细胞解剖实体（6,797）为主，其次是蛋白质-containing复合物（2,615）和病毒组分（63）。在分子功能分类中，结合（7,169）是最普遍的类别，催化活性（6,496）和转运蛋白活性（1,028）是后续的主要组。共有8,444条转录本在KOG数据库中进行了功能注释，并分为25个不同的类别。最丰富的功能类别是一般功能预测（1,769），其次是翻译后修饰、蛋白质周转、分子伴侣（1,266）和信号转导机制（1,158）。相比之下，细胞运动是注释最少的类别，仅有6条注释的转录本。与刺激反应和信号转导机制相关的转录本占主导地位尤其值得注意，因为它可能反映了沙地云杉固有的应激适应机制，该物种原产于恶劣的沙漠环境，其机制可能在SE的体外应激过程中被协同利用。

3.4 Analysis of KEGG pathway annotation

KEGG注释分析成功将11,895条沙地云杉转录本分配到五个主要类别的134条代谢途径中。代谢类别具有最高数量的注释基因（8,832），其次是遗传信息处理（1,583）、细胞过程（319）、环境信息处理（299）和有机体系统（213）。在特定的代谢途径中，代谢途径（2,187）是最丰富的类别，其中次级代谢物的生物合成（1,301）、碳代谢（431）和氨基酸的生物合成（353）在代谢类别中也显著代表。值得注意的是，先前的研究表明，碳源类型和浓度显著影响SE，在SE的三个关键调控因素（植物激素、碳源和氮源）中起着至关重要的作用。碳代谢以及淀粉和蔗糖代谢等途径的显著富集强调了表征SE的快速细胞增殖和分化所需的大规模代谢重编程和高能量需求。

3.5 Analysis of the long-read transcript structure

为了开发用于未来该濒危物种遗传研究和育种应用的分子标记，我们在转录组组装中识别并表征了SSR位点。使用MISA1.0对沙地云杉的12,232条异构体进行SSR分析，鉴定出1,006条（8.22%）包含SSR位点的序列。其中，159条序列包含两个或多个SSR位点，检测到1,231个SSR位点，包括二、三、四、五和六核苷酸重复。三核苷酸重复是最丰富的（846），其中AGC/CTG（242, 19.66%）、AAG/CTT（184, 14.95%）和AGG/CCT（149, 12.10%）是主要的 motif。此外，123条序列包含复合SSR位点。大多数重复（1,138）表现出4-7个重复单元，其次是8-11个重复（84）。

如第3.2节所示，大多数长读长序列得到了很好的注释。对于剩余的未注释转录本，使用CNCI和CPC软件进行编码潜力评估，鉴定出35个推定的lncRNA。我们使用INFERNAL基于保守序列和结构特征进行多序列比对、二级结构预测和协方差建模。然而，35个lncRNA中没有一个表现出显著匹配。这种缺乏注释可能由lncRNA的高序列分歧解释，特别是在沙地云杉等针叶树中，它们与当前数据库中充分代表的模式植物在进化上距离遥远。这些lncRNA中的许多可能是新颖且物种特异性的，可能参与SE过程中的谱系特异性调控过程。此外，现有数据库仍然偏向模式生物，限制了在非模式物种中基于同源性的检测。这些结果表明，沙地云杉可能拥有一组先前未表征的、快速进化的lncRNA，这些lncRNA可能在其独特的胚胎发生编程中发挥作用。未来的功能研究需要阐明它们的生物学意义。

使用SUPPA软件进行AS分析，揭示了83个AS事件，属于四种不同的类型：两个替代第一个外显子，17个替代5'剪接位点，28个替代3'剪接位点和36个内含子保留。此外，研究揭示65个（2.40%）unigenes只有一个异构体。1,365个（50.41%）、684个（25.26%）和305个（11.26%）基因分别包含两个、三个和四个异构体。发现十个（0.37%）基因存在超过十个剪接异构体。为了进一步探索这些AS事件的生物学相关性，我们对受影响的转录本进行了功能富集分析。KEGG通路分析显示，这些异构体在淀粉和蔗糖代谢以及鞘脂代谢中显著富集。淀粉和蔗糖代谢的富集尤其值得注意，因为它与我们先前的转录组学和代谢组学发现一致，并强调了碳源重编程在支持SE高能量需求中的关键作用。此外，GO分析显示在与光合作用（例如，光系统I/II）和类囊体膜等细胞组件相关的术语中富集，表明AS在伴随胚胎发生的代谢重组中的作用。

3.6 Prediction of transcription factor families

通过对长读长转录组测序数据的全面分析，我们使用hmmScan针对TF数据库进行比对，从12,232条长读长转录本中识别出548个TF，属于46个不同的TF家族。C3H家族是最丰富的TF组（46, 8.39%），其次是bHLH（37, 6.75%）、trihelix（35, 6.39%）、bZIP（35, 6.39%）和MYB-related（34, 6.20%）家族。除了TF的整体目录之外，我们试图识别与胚性能力获得 specifically相关的关键调节因子。通过分析跨阶段的表达水平，我们发现除了AP2之外，来自NAC、NF-Y和LBD家族的几个TF在EC中与NEC相比 specifically表现出显著上调。例如，ABI4在EC中的表达增加了104倍以上，表明它们是参与启动SE的潜在新候选者。

3.7 Cloning and bioinformatics analysis of the PmBBM

基于长读长转录组测序数据，通过筛选和比较分析鉴定出一个2,367 bp的基因，编码788个氨基酸（GenBank登录号PV941855），并将其命名为PmBBM。PmBBM的编码蛋白分子量为86,633.16 Da，等电点为5.85。有82个带负电荷的残基和68个带正电荷的残基。含量最高的氨基酸是丝氨酸，占12%，而半胱氨酸和色氨酸含量最少，各占1%。该蛋白的分子式确定为C₃₆₉₉H₅₇₆₆N₁₁₀₄O₁₂₄₀S₃₄，总原子数为11,843个。该蛋白的脂肪族指数为61.50，表明稳定性高。

亲水性/疏水性结果表明大多数区域得分为负值，表明主要是亲水性。跨膜结构域预测显示PmBBM中不存在跨膜螺旋。信号肽分析证实该蛋白中不存在信号肽。

预测的PmBBM蛋白二级结构由13.96%的α-螺旋、5.71%的延伸链和80.33%的无规则卷曲组成。对于三级结构预测，使用模板（PDB ID: A0A088BUC1.1.A）构建了PmBBM的3D模型，其全局模型质量估计（GMQE）得分为0.45，与包含AP2结构域的蛋白质序列相似度为93.27%。这些结果表明这是一种结构多样的蛋白质，具有丰富的卷曲和螺旋。磷酸化位点预测揭示了107个潜在位点，包括27个苏氨酸、71个丝氨酸和9个酪氨酸残基。此外，使用SMART进行的保守结构域分析表明，PmBBM包含两个AP2结构域。

将PmBBM的推导氨基酸序列与来自拟南芥、欧洲油菜、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）、犬蔷薇和黑杨（Populus nigra）的其他BBM蛋白使用DNAMAN软件进行比较。PmBBM拥有两个AP2结构域（AP2-R1和AP2-R2）和一个位于它们之间的连接区（linker），表明PmBBM属于AP2家族。此外，RcBBM包含bbm-1 motif，并且所有motif在euANT谱系中都是保守的：euANT2、euANT3、euANT4、euANT5和euANT6。系统发育树显示，PmBBM与落叶松（Larix decidua）BBM的遗传关系最密切。这种与另一种针叶树物种的BBM直系同源物的紧密聚类强烈支持了我们克隆基因的身份，并表明其功能在针叶树胚胎发生中的进化保守性。

3.8 Subcellular localization of GFP-PmBBM in transiently transformed tobacco

为了确定PmBBM的精确亚细胞定位，我们开发了融合表达载体p35S::PmBBM-GFP，该载体能够通过根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的递送在烟草叶片中表达融合蛋白。研究结果描绘显示，p35S::PmBBM的荧光信号与细胞核标记物RFP的信号相对应。因此，预计它主要存在于细胞核中，在细胞质中的表达极少。

3.9 PmBBM and AP2 transcription factor family expression profiling during SE in P. mongolica

基于我们对沙地云杉SE关键阶段的转录组测序结果，我们分析了PmBBM和其他AP2转录因子家族基因在NEC、EC、GSE、LSE、MSE和EP中的表达模式。显示PmBBM在体细胞胚形成和发育过程中强烈表达，在EC中水平最高；然而，其在NEC和EP中的表达极微。AP2家族基因显示出两种不同的表达模式：在SE过程中高表达的基因，如BBM、WRI1和AIL5；以及主要在NEC或EP中表达的基因，包括ANT、EPF和AP2。我们的表达分析揭示，特定的AP2/ERF基因（特别是PmBBM）在沙地云杉的SE过程中动态表达，表明它们在这一特定发育过程中的潜在调控作用。

4 Discussion

本研究旨在阐明濒危针叶树沙地云杉SE的分子基础，特别侧重于识别关键调控基因。通过采用PacBio SMRT测序，我们建立了一个基础的转录组资源，使我们能够成功克隆和表征SE中的核心转录因子PmBBM的动态表达。系统发育分析显示，PmBBM与来自另一种针叶树物种落叶松的BBM蛋白进化关系最密切。这种高度保守性表明BBM的胚胎发生功能可能在针叶树中共享，为推断PmBBM在SE中的作用提供了强大的系统发育基础。此外，表达谱分析表明，PmBBM主要在早期体细胞胚形成过程中表达，这与其作为胚胎发生发育诱导物的推定作用一致。

这些发现补充了我们先前关于SE过程中阶段特异性表达动态的工作，为未来的功能研究提供了必要的基因组基础设施。本文采用的PacBio长读长测序方法克服了短读长组装在区分密切相关的旁系同源物和选择性剪接异构体方面的固有局限性。我们已经准确识别了：12,232条高质量长读长转录本序列，作为基因注释的明确参考；83个选择性剪接事件和35个lncRNA，这些是先前未表征的；以及关键调节因子如PmBBM的完整编码序列（CDS）和结构，使其功能克隆和表征成为可能。使用此处生成的参考分析的PmBBM阶段特异性表达模式与我们之前的发现一致并扩展了这些发现，强调了该TF家族在整个SE过程中的持续重要性。本文鉴定的SSR标记和lncRNA为进一步研究我们先前多组学研究中发现的机制提供了一套新的工具和靶点。

在一项类似的研究中，Li等人采用整合的NGS-TGS方法分析了来自白芨（Bletilla striata）悬浮培养物的混合样本（跨越10个发育阶段的23个标本）。他们的研究产生了100,276条高质量长读长转录本，包括53,316条KOG注释的unigenes（分为26个功能类别）和8,020条KEGG映射的unigenes（分配到363条通路）。此外，他们还鉴定了15,133个lncRNA和68,996个包含SSR的编码序列。类似的长读长转录组研究已在多种植物物种中报道，包括侧柏（Platycladus orientalis）、马铃薯（Solanum tuberosum）和山丹（Lilium pumilum）。如这些研究所示，TGS已成为在非模式植物中开发基因组资源和分子标记的强大工具。

AS是调节基因表达和蛋白质多样性、增加转录组复杂性和修改发育过程的关键机制。在SE过程中，AS参与关键的生物过程，包括细胞命运决定、形态发生和信号转导。Du等人系统分析了玉米愈伤组织诱导不同阶段的AS模式，每个阶段识别出超过2,000个剪接事件。值得注意的是，参与剪接体组装、代谢途径和mRNA监视的基因在愈伤组织诱导过程中表现出显著的AS动态。他们的研究结果表明，AS与转录调控协同促进愈伤组织形成。类似地，在落叶松中，microRNA171及其靶基因LaSCL6产生两种选择性剪接的异构体来调控SE。对人参（Panax ginseng）的研究进一步证明，PgCDPK2d亚家族，特别是其选择性剪接变体，在功能上 contributes to the SE。在本研究中，PacBio长读长转录组测序鉴定出沙地云杉SE过程中188个表现出AS的异构体。KEGG分析发现这些基因主要富集于光合作用、淀粉和蔗糖代谢以及鞘脂代谢等途径。在沙地云杉SE过程的转录组和代谢组研究中，我们还发现差异表达基因和代谢物在淀粉和蔗糖合成途径中显著富集。

为了解决代谢途径的阶段特异性，我们检查了植物激素信号转导通路内基因的表达模式。尽管PacBio测序是在混合样本上进行的，但我们阶段特异性RNA-seq数据揭示了 distinct的植物激素动态：生长素和细胞生长反应基因（例如，XTH, LAX）主要在EC和NEC阶段表达，这与它们促进细胞分裂和胚胎发生诱导的作用一致。相反，与脱落酸（ABA）和赤霉素（GA）信号传导相关的基因（例如，GAI, PYL, SRK）在GSE和MSE阶段显示表达升高，这与其