单细胞转录组学揭示食管小细胞癌上皮及微环境异质性：免疫抑制与基质重塑的新机制

本研究通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）系统解析了食管小细胞癌（SCCE）的细胞异质性与微环境特征，揭示了其独特的免疫抑制表型（如免疫检查点基因下调）、恶性上皮细胞亚型（SCCE_A/ASCL1+、SCCE_P/POU2F3+、SCCE_N/NEUROG3+）及癌症相关成纤维细胞（CAFs）介导的胶原信号网络，为这一罕见恶性肿瘤的精准治疗提供了新视角。

　　

引言

食管小细胞癌（SCCE）是一种罕见但高度侵袭性的神经内分泌恶性肿瘤，占所有食管癌的不足3%。其特点是进展迅速、早期转移和临床预后差，中位生存期仅8至13个月。由于缺乏新鲜肿瘤样本和成熟的实验模型，SCCE的发病机制和潜在治疗靶点尚未得到深入解析。单细胞技术的进展为解析实体瘤的细胞异质性和微环境复杂性提供了新工具，但SCCE在这一分辨率下的特征仍不清楚。

材料与方法

研究共纳入23例食管组织样本，包括食管腺癌（EAC）、食管鳞状细胞癌（ESCC）、SCCE以及来自ESCC和EAC病例的癌旁正常组织（NT）。其中3例SCCE肿瘤样本通过单核RNA测序（snRNA-seq）从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织中获得，其余20例样本来自公共数据集。数据处理使用Cell Ranger和Seurat软件，通过inferCNV识别恶性上皮细胞，并利用CytoTRACE2和Monocle2进行分化评分和伪时间轨迹分析。转录因子调控网络通过pySCENIC分析，细胞间通讯通过CellChat评估。

结果

单细胞转录组图谱揭示食管组织细胞组成异质性

整合分析识别出10个主要细胞类型，包括上皮细胞、成纤维细胞、肥大细胞、浆细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞（DCs）、T细胞、B细胞和NK细胞。SCCE样本显示上皮细胞显著富集，而免疫细胞（如T细胞和巨噬细胞）比例减少。转录组分析显示SCCE具有独特的基因表达特征，与EAC和ESCC明显不同。

恶性上皮细胞的识别与功能特征

通过inferCNV分析发现SCCE上皮细胞具有显著的染色体不稳定性（CNV），尤其19号染色体扩增最为常见。功能评分显示SCCE恶性细胞上皮间质转化（EMT）、增殖和血管生成评分较高，但抗原呈递能力下降。基因集变异分析（GSVA）显示SCCE富集于有丝分裂纺锤体、血管生成和EMT相关通路，而ESCC更富集于免疫和代谢相关通路。神经内分泌（NE）标记评分在SCCE中显著升高，Wnt信号活性增强，而Notch和Hippo通路活性降低。

SCCE恶性上皮细胞的分子异质性

恶性上皮细胞进一步分为9个转录亚群，并归纳为三种分子状态：α（簇2、4、6）、β（簇1、5、7、8）和γ（簇0、3）。α状态表现出高EMT和中等增殖，β状态高EMT和低抗原呈递，γ状态则高增殖和高CNV。转录因子分析揭示各状态特有调控网络，并定义出三种分子表型：SCCE_N（NEUROG3⁺）、SCCE_P（POU2F3⁺）和SCCE_A（ASCL1⁺）。

轨迹分析揭示SCCE上皮细胞分化路径与分子程序

伪时间轨迹显示SCCE_P位于轨迹根部，具有最高分化潜能，提示其祖细胞样特性。SCCE_N和SCCE_A则分布于两个终端分支，分别伴随NEUROG3和ASCL1表达上升。基因模块分析表明，P-to-N轨迹富集于干细胞性和T细胞分化相关基因，而P-to-S轨迹与上皮发育和神经发育过程相关。

免疫景观分析显示SCCE中淋巴与髓系细胞的重构

T/NK细胞分为8个亚群，SCCE中CD4_Trm细胞比例显著升高，而CD4_Treg和CD8_Tem减少。免疫检查点基因（如PDCD1、CTLA4、LAG3、TIGIT）在SCCE中普遍下调。髓系细胞中，M1巨噬细胞减少，肥大细胞和中性粒细胞增加。功能评分显示SCCE中抗原呈递、T细胞活化和干扰素相关通路普遍抑制。

成纤维细胞异质性与ELF3相关转录特征

成纤维细胞分为肌成纤维细胞CAFs（myCAFs）、炎症CAFs（iCAFs）和细胞外基质CAFs（eCAFs）。eCAFs在SCCE中显著富集，其转录因子ELF3调控活性升高。KEGG分析显示ELF3靶基因与钙黏蛋白结合、GTP酶活性和激酶信号调控相关。iCAFs高表达COL1A1、POSTN、DCN和CD248，与胶原代谢和细胞黏附相关。

SCCE展现独特的细胞间通讯模式

SCCE具有最复杂的细胞间相互作用网络，胶原信号通路最为显著。iCAFs是胶原配体的主要来源，介导与多种免疫和基质细胞的通讯。网络中心性分析显示成纤维细胞在SCCE信号传递中起主导作用。

讨论

本研究通过单细胞转录组学揭示了SCCE独特的肿瘤生态系统，包括显著的基因组不稳定性、恶性上皮细胞的转录异质性、免疫抑制微环境以及成纤维细胞介导的信号网络。分子分型（SCCE_A、SCCE_P、SCCE_N）与SCLC有相似之处，但SCCE_N亚型具有独特性。免疫检查点基因的广泛下调提示SCCE可能对免疫检查点抑制剂（ICIs）反应有限。ELF3在eCAFs中的调控作用以及iCAFs驱动的胶原信号网络为靶向基质微环境提供了新思路。研究的局限性包括样本量小、缺乏实验模型和预后验证，未来需更大样本和功能研究支持。

结论

该研究构建了SCCE的高分辨率单细胞图谱，揭示了其细胞异质性、免疫抑制特征和基质重构机制，为理解这一罕见肿瘤的生物学基础和发展精准治疗策略提供了重要资源。