酶解HPLC-UV法精准测定复合酵母培养物中α-甘露聚糖含量及其应用研究

本文建立了一种基于α-甘露糖苷酶特异性酶解结合高效液相色谱-紫外检测（EH-HPLC-UV）的分析方法，用于复合酵母培养物（CYC）中功能性成分α-甘露聚糖（α-mannan）的精准定量。该方法通过优化酶解时间（17 h）、衍生化反应（10 min）及提取次数（4次），实现了高线性（R2=0.99998）、高灵敏度（LOD=0.063 mg/L）和高回收率（88.020%–94.204%），有效克服了β-甘露聚糖的基质干扰，为CYC产品质量控制及功能成分研究提供了可靠技术支撑。

　　

背景

复合酵母培养物（CYC）是一种通过特殊发酵工艺制备的新型微生态制剂，由酵母细胞代谢产物、变性培养基及少量灭活酵母细胞组成。其核心功能性成分α-甘露聚糖（α-mannan）的含量直接影响产品质量与功效。然而，CYC基质复杂，同时含有酵母来源的α-甘露聚糖和植物底物来源的β-甘露聚糖（β-mannan）。这两种甘露聚糖在糖苷键构型（α型与β型）和空间结构上存在根本差异，导致其理化性质及生理功能显著不同。传统多糖分析方法（如苯酚-硫酸法或酸水解法）无法区分两类甘露聚糖，严重干扰CYC中功能性α-甘露聚糖的定量检测，成为制约产品质量控制与功能评价的关键技术瓶颈。

材料与方法

2.1 复合酵母培养物（CYC）的制备

本研究使用的CYC由实验室自主开发制备。菌株来源为内蒙古农业大学兽医学院微生物制剂课题组保藏的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，菌株编号BC）和马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus，菌株编号XR4）。固体发酵培养基由麸皮（20%）、喷干玉米皮（12%）、玉米粉（10%）、米糠（10%）、棉籽粕（10%）、玉米胚芽粕（28%）和豆粕（10%）组成。发酵采用堆肥法（堆高70–80 cm），温度控制在30°C，发酵72 h后经低温干燥（45–50°C）得到终产品。

2.2 主要试剂与材料

衍生化试剂PMP-甲醇溶液（0.5 mol/L）现配现用；α-甘露糖苷酶（来源于刀豆，Sigma-Aldrich）使用前用超纯水稀释为酶液A（Enzyme A）；酵母甘露聚糖对照品由实验室制备，纯度约11%；14种市售酵母培养物类似物样品购自不同厂家。

2.3 实验方法

2.3.1 样品前处理

所有待测样品及酵母甘露聚糖对照品经粉碎过60目筛备用。

2.3.2 样品水解

精确称取50–120 mg样品，加入2.0 mL预冷的12 M硫酸溶液，冰水浴反应30 min后加10 mL超纯水，沸水浴继续反应30 min。水解液用50 mM MES缓冲液（pH 5.5）定量转移，经NaOH初步中和后调节pH至4.5–5.5，定容。取1–2 mL稀释液离心，取0.2 mL上清液加入0.2 mL酶液A，37°C水浴酶解17 h。

2.3.3 衍生化反应

酶解后加入400 μL PMP-甲醇溶液和400 μL NaOH（0.3 M），70°C水浴反应10 min，再用500 μL HCl（0.3 M）中和。氯仿萃取4次，取水相离心过滤后进行HPLC-UV分析。

2.4 HPLC-UV分析条件

采用Agilent 1260系统，Acclaim? C30色谱柱（5 μm, 4.6 × 250 mm），流动相为0.1 mol/L乙酸铵溶液（pH 5.5）-乙腈（75:25），流速1.0 mL/min，柱温35°C，进样量10 μL，检测波长254 nm。

2.5 α-甘露聚糖含量计算公式

通过引入校正因子（F）修正实验过程中的损失与降解，计算公式如下：

X_i = (c₁ × V₁ × n / m₁) × 0.9 × F × 10^?4

F = P(100% ? W) / X_i-control

X_i-control = (c₂ × V₂ × n / m₂) × 0.9 × 10^?4

其中X_i为样品中α-甘露聚糖含量（%），X_i-control为对照品含量，c₁、c₂为甘露糖浓度（μg/mL），V₁、V₂为定容体积（mL），n为稀释倍数（n=8.5），0.9为甘露糖至α-甘露聚糖的转换系数，m₁、m₂为样品质量（g），P为对照品纯度（%），W为水分含量（%）。

2.6 方法学验证

通过线性、精密度、重复性和加标回收试验验证方法性能。甘露糖标准曲线在0.5–400 μg/mL范围内线性良好（y=79.89734x+7.50992，R2=0.99998），LOD和LOQ分别为0.063 mg/L和0.208 mg/L。精密度试验（5、50、100 μg/mL）和重复性试验RSD均低于1%。加标回收率在88.020%–94.204%之间，RSD为0.702%–2.259%。

2.7 检测方法的应用

采用EH-HPLC-UV法检测14种市售样品及实验室制备CYC中的α-甘露聚糖含量，每组样品独立测量三次。

2.8 统计分析

数据采用GraphPad Prism 9.5.1进行单因素方差分析（ANOVA）和Tukey事后检验，结果以均值±标准差表示，P<0.05为显著差异。

结果

3.1 酶解时间的优化

酶解时间在12–18 h范围内，甘露糖衍生物浓度随时间的延长而逐渐增加。17 h时甘露糖衍生物浓度为12.664±0.101 μg/mL（P<0.001），RSD为0.795%，水解度（DH）达94.700%。延长至18 h浓度无显著变化（P>0.05），但RSD略升至0.971%。因此确定17 h为最佳酶解时间。

3.2 衍生化时间与提取次数的选择

衍生化反应时间（10、30、60 min）对甘露糖衍生物峰面积无显著影响（P>0.05），故选择10 min以提高效率。氯仿提取次数试验表明，提取4次后PMP峰面积接近零，确定为最佳提取次数。

3.3 方法学验证结果

标准曲线线性优异，LOD和LOQ极低。精密度和重复性试验RSD均低于1%，加标回收率在88.020%–94.204%之间，RSD为0.702%–2.259%，表明方法准确可靠。

3.4 EH-HPLC-UV与HPLC方法的比较

EH-HPLC-UV法校正因子F=1.113（RSD=3.978%），传统HPLC法F=1.507（RSD=3.095%）。EH-HPLC-UV法F值更接近1，准确度更高。

3.5 EH-HPLC-UV检测方法的应用

14种市售样品中α-甘露聚糖含量差异显著，除样品11外其余均未达到标称值（≥2.0%或≥25%）。多数样品含量在0.5%–1.5%之间，样品10和12含量较高。78.6%的样品RSD高于2.0%，表明复杂基质可能影响检测重现性。

讨论

植物中的甘露聚糖主要以β-甘露聚糖形式存在，是半纤维素家族的重要成员，其核心结构为由β-1,4-糖苷键连接的甘露糖残基主链，可能伴有葡萄糖和甘露糖残基的组合以及α-1,6-连接的半乳糖侧链。β-甘露聚糖参与细胞壁代谢，在植物生长、成熟和衰老过程中起关键作用，常富集于豆科植物胚乳中，并广泛存在于各类饲料谷物中。但由于可能干扰营养消化利用，被视为抗营养因子。相比之下，酵母中的甘露聚糖为α-甘露聚糖，是一种具有免疫刺激特性的生物活性多糖，被视为重要营养素。CYC通过酵母菌株发酵农副产品生产，因此同时含有α-甘露聚糖和β-甘露聚糖。α-甘露聚糖的特异性检测需采用专属酶解策略。本研究使用的α-甘露糖苷酶是一种酸性水解酶（GH 38家族），能够水解α-1,2-、α-1,3-和α-1,6-糖苷键，从各种合成和天然α-甘露糖苷中释放甘露糖。研究发现α-甘露糖苷酶单独使用即可水解α-甘露聚糖的主链和侧链，释放甘露糖，与Dohi等人和刘等人的研究结果一致。

酶解时间优化实验中确定17 h为最佳时间，与刘等人报道的16 h接近，但与Dohi等人报道的1–8 h差异较大。这种差异可能源于以下几方面因素：（1）甘露聚糖底物的来源、构型、结构和分子量不同；（2）底物浓度差异可能导致底物抑制效应；（3）刀豆α-甘露糖苷酶的切割特异性和途径存在变异。未来研究可探讨不同底物浓度的影响，并评估GH92和GH99家族α-甘露糖苷酶的协同使用效果，以提高水解效率并缩短孵育时间。

本研究采用PMP衍生化结合HPLC-UV分析进行单糖分析，实现了甘露糖的高灵敏度检测。甘露糖衍生化反应10 min内即可达到平衡，而葡萄糖衍生化需60 min，与范B报道的30 min不同，这种差异主要源于衍生样品中单糖含量的不同。因此需根据具体研究背景调整衍生化时间，尤其在目标分析物浓度未知时需进行初步试验确定最佳持续时间。

多糖水解分析中，强酸水解因高效简便而被广泛应用，但强酸可能促进单糖转化为呋喃化合物（如糠醛和羟甲基糠醛），干扰含量分析。因此需引入多糖对照品推导校正因子以补偿不可避免的水解损失和降解。校正因子越接近1表明准确度越高。本研究采用酵母甘露聚糖对照品进行校准，评估了EH-HPLC-UV和HPLC方法对酵母甘露聚糖对照品定量的影响。结果表明EH-HPLC-UV法获得的校正因子（平均F=1.113）更接近1，表明酶系统在水解糖链方面具有更好的可控性，且酵母甘露聚糖对照品有效校正了水解损失。此外本研究观察到的F值范围（1.046–1.177）与周等人报道的范围（0.86–1.18）部分重叠，证实了实验中校正的必要性，支持了本研究方法的可靠性。值得注意的是实验初期每批运行应包含对照品以确保即时校正，一旦实验程序稳定且操作人员技术熟练后可每月更新校正因子。

本研究建立的EH-HPLC-UV方法与传统HPLC方法在α-甘露聚糖定量方面表现出明显不同的特性。尽管传统HPLC方法依赖酸解释放单糖，操作更简单成本更低，但其主要局限在于无法区分α和β构型的甘露聚糖。在复合酵母培养物等含有植物源性β-甘露聚糖的复杂样品中，该方法容易产生与真实值的偏差。相比之下，EH-HPLC-UV方法采用α-甘露糖苷酶特异性酶解α-甘露聚糖，尽管需要17 h水解过程且依赖相对昂贵的酶试剂，但显著提高了目标成分定量的准确性和特异性。特别适用于复杂样品基质，并在具有显著基质效应的实际样品中表现出优异的抗干扰能力和结构识别能力。然而该方法也存在明显局限，包括预处理时间长、操作步骤多、依赖特定酶等，可能限制其在高通量常规检测中的应用。因此该方法更适用于需要高精度、复杂样品基质或α-甘露聚糖特异性识别的场景，如功能成分验证、产品质量控制和标准化。未来研究可致力于优化酶解效率、开发低成本酶替代品以及整合或自动化程序步骤，以提升方法的操作便利性和经济可行性，从而扩展其在实际检测工作流程中的广泛应用潜力。

MES缓冲溶液是一种两性离子缓冲液，有效pH范围为5.5–7.0，具有良好的缓冲能力、低离子强度、无金属螯合效应且不干扰酶活性。由于这些特性，MES缓冲溶液广泛应用于生化和分子生物学实验。本研究考虑酶活性高度依赖pH且反应持续时间长（17 h），需要一种能够提供长时间稳定pH控制的缓冲液以最小化可能影响酶性能的波动，因此经综合评估选择MES。刘等人和Dohi等人的研究也支持MES适用于 prolonged enzymatic reactions，为本研究使用提供了理论基础。

本研究采用EH-HPLC-UV方法分析了14种商业酵母培养物产品样品，结果显示不同厂家产品α-甘露聚糖含量存在显著差异。这种差异可归因于以下因素：（1）酵母细胞壁多糖组成因菌株和培养条件而异；（2）甘露聚糖的结构和含量受菌株和培养条件强烈影响；（3）甘露聚糖的生物合成途径及相关基因表达在酵母菌株间存在变异。此外本研究测量的甘露聚糖含量与商业产品标注值存在显著差异，检测值普遍低于声称值，这种差异可能源于检测方法的不同。目前中国尚无强制规定的标准化检测方法，产品标签通常未注明使用的分析技术，难以评估声称值的准确性或CYC产品中真正的α-甘露聚糖含量。因此有必要建立α-甘露聚糖分级标准并统一检测方法以规范市场实践。本研究开发的EH-HPLC-UV方法能够定量检测多样化商业样品中的α-甘露聚糖，可作为一种新颖的分析方法，为CYC的质量控制和产品开发提供技术支持，并为未来研究和生产提供宝贵的数据参考。

结论

本研究成功建立了一种酶解-HPLC（EH-HPLC-UV）方法用于CYC中α-甘露聚糖的定量检测。尽管该方法相较于传统HPLC需要更长的预处理时间，但通过利用α-甘露糖苷酶的特异性酶解，显著提高了α-甘露聚糖定量的准确性和特异性，有效避免了样品中β-甘露聚糖的交叉干扰。验证表明该方法在线性范围（0.5–400 μg/mL）、精密度、重复性（RSD<1%）和加标回收率（88.020%–94.204%）方面表现良好。此外14种商业样品的检测结果证实了其在实际应用中的可靠性和稳定性。尽管该方法在通量和成本方面存在一定局限，但其在复杂基质中特异性识别目标活性成分的能力使其非常适用于CYC产品的质量控制和功能成分分析。本研究为CYC中功能性多糖的质量评估提供了一种可行且高特异性的分析方法，对相关饲料和功能性食品产品的进一步发展和标准化做出了积极贡献。