综述：发育过程中超昼夜振荡在神经发生中的重要性及其对脊髓再生的启示

本综述深入探讨了神经干细胞（NSC）命运决定中一个新兴的核心机制：转录因子（如HES/Her家族）的超昼夜振荡（周期数小时）。文章系统阐述了这种动态信号编码如何通过整合microRNA（miRNA）等调控，精细平衡神经发生与胶质发生，并特别聚焦于其在脊髓损伤（SCI）后调控静息NSC再激活与再生神经发生中的潜在作用，为理解哺乳动物再生能力缺失及开发再生疗法提供了新颖的动态视角。

　　

1 引言

中枢神经系统（CNS）的发育是一个复杂的多步骤过程，依赖于神经干细胞（NSC）增殖与分化的精密调控。近年来，动态信号编码，特别是超昼夜振荡（ultradian oscillations）——即蛋白质水平在数小时内发生的规律性波动——已成为理解NSC命运决定的关键机制。在成年机体中，静息NSC的再激活、增殖和分化同样受此振荡调控。这些动态过程受到microRNAs（miRNAs）的调节，对于神经祖细胞在不同状态间转换的能力至关重要。哺乳动物脊髓在损伤后，其内源性的多能NSC主要分化为星形胶质细胞，而缺乏神经发生；相比之下，许多非羊膜动物（如斑马鱼和蝾螈）却能实现成功的脊髓再生。这表明，信号通路调控方式的细微差异可能导致截然不同的再生结局。本综述旨在探讨转录因子超昼夜振荡在神经发生中的作用、miRNA对其的调控，以及这些动态过程在脊髓损伤修复背景下的潜在意义。

2 发育中的神经发生：振荡性基因表达的作用

振荡动力学能够编码比单纯蛋白水平更丰富的信息，包括信号持续时间、频率、倍数变化和振荡次数。超昼夜振荡（周期数小时）在发育过程中的神经发生控制中扮演着重要角色。其机制通常涉及一个负反馈环路与生物学时间延迟的结合，这些延迟与转录、翻译以及mRNA和蛋白质的稳定性等细胞过程内在相关。

在NSC和神经祖细胞（NPC）中，特征最明确的超昼夜振荡器是Notch信号的下游靶标——Hairy and Enhancer of Split（HES/Her）转录抑制因子。HES/Her蛋白作为同源或异源二聚体结合E-boxDNA序列，并招募辅抑制因子来抑制靶基因表达。它们通过负向自我调控，驱动自身及其靶基因（如proneural基因Ngn2和Ascl1）的振荡性表达。

2.1 HES/Her超昼夜振荡在神经发育中的作用

在脊椎动物中，HES/Her蛋白振荡通过协调细胞事件发生的时间，在神经发育中起关键作用。与体节发生中的同步振荡不同，NPC中的振荡往往是异步的，因此需要单细胞成像技术来检测。研究表明，HES1和Notch配体Dll1的mRNA和蛋白在小鼠胚胎神经上皮中均以Notch依赖的方式振荡。Proneural基因Neurogenin2（NGN2）同样在神经祖细胞中呈振荡性表达。抑制Notch信号会下调HES1并持续上调NGN2和Dll1，表明HES1的振荡性表达调控着NGN2和Dll1的振荡，从而通过Notch信号的相互激活来维持神经祖细胞状态。

2.2 超昼夜振荡与神经细胞命运选择

多种细胞命运决定因子（如HES1、Ascl1和Olig2）在未分化的神经祖细胞中共表达，并呈现振荡性表达。然而，在分化为神经元、少突胶质细胞或星形胶质细胞时，通常单一命运决定因子会以持续、非振荡的方式高水平表达。这表明转录因子的不同动态表达（振荡vs.持续）可能介导了增殖与分化之间的选择。

功能实验强有力地支持了这一理论。例如，使用光诱导基因表达结构对proneural基因Ascl1进行振荡性诱导可促进增殖，但不能在Ascl1缺陷的祖细胞中挽救神经发生；而持续表达则导致神经元分化。此外，人为延长或缩短Dll1或Hes1基因的长度会消除神经祖细胞中Hes1的振荡，导致小鼠大脑尺寸减小，这可能是由于神经分化加速继而耗竭了祖细胞池所致。

振荡动力学的重要性在于，它允许分化发生。近期研究报道，神经祖细胞的分化 preceded by 一个从嘈杂、非周期性的基因表达波动向稳定、振荡动力学的转变。防止这种转变会延迟神经发生，使细胞停滞在分化的中间阶段，表明振荡性转录因子动力学支持细胞命运决定的进程。

2.3 miRNAs：发育过程中精细调控超昼夜振荡

miRNAs通过抑制翻译和/或促进脱腺苷化和mRNA降解来调控其靶mRNA。这两种调控模式都会减少蛋白质输出，因此可影响基于延迟负反馈的遗传振荡器的动力学。

数学模型表明，将翻译抑制和mRNA降解结合到一个延迟负反馈（自我抑制）模型中，系统可以产生持续的基因表达振荡。这些振荡仅在特定的mRNA半衰期范围内发生：降解太快或太慢都会使振荡减弱并最终消失。这表明miRNAs可通过调节mRNA降解速率来影响振荡行为。

在神经系统发育中，miRNA-9被证明可调控祖细胞基因（包括HES/Her转录因子）以及proneural基因的表达。敲低或过表达miRNA-9会导致HES1振荡减弱，支持了miRNA浓度“窗口”可维持转录因子振荡的理论。反之，HES1也抑制miRNA-9前体的表达，形成一个相互抑制的环路。将这种相互抑制模式纳入数学模型引入了双稳态，使细胞能够采用HES1低（分化）或HES1高（静息）状态。因此，miRNA介导的HES1动力学调控可能是平衡祖细胞维持、静息和分化的关键。

3 基因表达动力学与静息祖细胞的再激活：对神经修复的启示

Notch信号已知可调控神经祖细胞在静息和增殖状态之间的转换。高且持续的HES1表达与低增殖区域相关，其过表达会延长G期并减弱增殖。相反，缺失Notch1受体或其效应因子Rbpj会导致过早分化和NSC耗竭。这些发现表明Notch对于维持成年小鼠静息干细胞库至关重要。

最近，基因表达的动态模式被证实与调控NPC静息有关。振荡性和持续性的HES1动力学对细胞周期进程有相反效应：振荡性HES1表达支持增殖并驱动p21（G1/S期转换的负调控因子）的振荡；而持续表达则通过抑制ERK信号上调p21表达，从而抑制增殖。在静息和激活细胞中Hes1均振荡，但静息状态下振荡性HES1的表达水平更高。Ascl1在静息细胞中不表达，但在激活状态下呈现振荡性表达，诱导其振荡性表达可导致成年小鼠大脑中的干细胞激活。这表明振荡性Ascl1动力学激活了静息神经干细胞，而高水平的HES1通过抑制Ascl1来抑制再激活。

虽然Ascl1振荡可以驱动神经干细胞退出静息状态，但这很可能依赖于HES1动力学或蛋白水平。在静息的NSC培养模型中，HES1在增殖、静息和再激活状态中均保持其振荡性表达，表明振荡与所有三种状态兼容。然而，持续的HES1表达在支持增殖和进入静息的同时，阻止细胞退出静息状态，表明HES1振荡是静息细胞退出休眠状态所必需的。

4 讨论

4.1 再激活静息NSC用于脊髓修复

在所有研究的脊椎动物中，成年CNS都含有维持本构神经发生的NSC，以及响应损伤可被再激活的潜能在的NPC。然而在哺乳动物中，除了侧脑室室管膜下区（SVZ）和海马齿状回的NSC外，大多数CNS在成年期不支持新神经元的添加。静息态、具有NSC样特性的细胞可以从成年CNS的不同区域（包括脊髓）中分离出来。它们在损伤后主要生成星形胶质细胞和少量少突胶质细胞，但在体外具有产生新神经元的潜能。它们的激活表明内源性干细胞/祖细胞生态位可能在脊髓损伤（SCI）后有限的再生中发挥作用。

为了理解脊髓损伤后促进神经发生的内在机制，研究斑马鱼和蝾螈等再生物种非常有价值。斑马鱼在完全脊髓横断后能实现运动功能的完全恢复，这归因于几个关键过程：丢失神经元的再生、许可环境的产生、轴突的再髓鞘化以及功能神经环路的重建。

在成年斑马鱼中，SCI触发了被称为室管膜放射状胶质细胞（ERGs）的祖细胞的再激活和增殖。这些细胞具有再生多种神经元亚型的潜能。正常情况下，ERGs分裂缓慢，主要产生少突胶质细胞；然而损伤后，它们可以恢复到神经生成状态。哺乳动物中存在类似的室管膜细胞，损伤后也被触发增殖，但主要进行胶质发生，促进瘢痕组织形成。这种损伤反应的差异突出了研究神经干细胞（或ERGs）如何在损伤后被再激活并导向神经元命运的价值。

4.2 Notch信号动力学与NSC静息的调控：对脊髓修复的启示

从成年小鼠脊髓中分离的静息NSC在体外保留着再激活并产生多种细胞类型的潜能。然而，这种潜能体内似乎受限，脊髓损伤后主要限于星形胶质细胞的生成， likely due to the activation of Notch signalling in the NSC niche。矛盾的是，Notch信号在成年斑马鱼SCI后也会上调，然而在此背景下，它支持成功的神经发生再激活和多种神经元亚型的再生。因此，Notch信号通路调控的细节可能对再生性神经发生是否发生至关重要。

在发育过程中，Notch靶标Ascl1是神经元和少突胶质细胞Specification所必需的，其在少突胶质发生中的表达受振荡性表达的HES5调控。值得注意的是，Ascl1本身在少突胶质细胞前体细胞（OPCs）中振荡， albeit at lower amplitude than in neuronal precursors。持续的Ascl1表达会以牺牲少突胶质细胞为代价，使细胞命运偏向神经元。这些观察表明，由HES/her动力学驱动的Ascl1表达动力学可能是决定神经元和胶质细胞命运平衡的关键调控机制。

在成年哺乳动物NSC中，Ascl1是静息细胞再激活所必需的，其振荡性表达驱动小鼠神经源性区域中从静息到神经元分化的转变。这一过程很可能由HES1振荡所主导。例如，表现出持续HES1表达的NSC未能退出静息状态， potentially due to the inability to reinitiate Ascl1 oscillations。Ascl1a的表达在成年斑马鱼SCI后的分化神经元中检测到，而在成年大鼠中，Ascl1在少量少突胶质细胞祖细胞中表达，其过表达刺激的是少突胶质细胞而非神经元的产生。Ascl1表达动力学的差异是否会影响SCI后的分化结局，例如诱导神经元或少突胶质细胞选择之间的命运转换，仍有待研究。

4.3 miRNAs在脊髓修复中的作用：基因表达动力学的调控者？

miRNAs与脊髓损伤的发病机制有关，在SCI后表现出表达失调。因此，操纵miRNAs作为治疗SCI的策略受到了相当多的关注。有证据表明，调节miRNA表达能够创造一个允许再生的环境。

对于miRNAs能够调整靶基因表达动力学，其水平必须被精确控制。例如，过多或过少的miR-9都会导致HES1振荡减弱。在后脑发育中，miR-9的水平以尖锐的、阶梯式的方式随时间增加，这是由不同miR-9前体表达开始的时空差异所控制的。然而，响应SCI的miRNA前体转录表达的调控机制仍属未知。在成年脊椎动物中，miRNA也可以通过包裹在外泌体中通过脑脊液递送到损伤部位。这种miRNAs的外泌体递送作为促进SCI后恢复的潜在治疗策略已被广泛研究。然而，为实现最佳治疗效果所需的递送水平和时机仍需解决。

4.4 研究脊髓修复过程中基因表达动力学的潜在方法

理解转录因子的超昼夜振荡在过去20年中日益受到关注，这与活体生物中可视化基因表达动力学的技术的发展紧密并行。尽管取得了这些进展，在整个生物体的CNS中可视化超昼夜振荡仍然是一个重大挑战。随着CRISPR-Cas技术和敲入模型的出现，标记内源蛋白的工具变得更容易获得。然而，活体成像仍然是一个主要障碍。迄今为止，大多数研究是在分离的NSC、NPC、离体小鼠组织切片中，或在斑马鱼胚胎和幼体的活体内进行的。由于神经系统再生的复杂组织环境，细胞培养或组织切片模型并不适合研究这些条件下的基因表达动力学。因此，推动该领域发展，特别是在脊髓损伤的背景下，需要进一步创新以使得在成年生物体中进行此类研究成为可能。

近期成像技术的进步提供了有希望的方向。例如，在成年斑马鱼中，多光子显微镜的应用，特别是活体三光子显微镜（3PM），允许在透明斑马鱼的成年大脑中进行深达300 μm、具有亚细胞分辨率的成像。然而在哺乳动物中，较低的组织透明度带来了额外的挑战。因为哺乳动物组织对近红外（NIR）光相对透明，使用近红外荧光蛋白（NIR-FPs）结合3PM可以实现对深达3 mm组织的非侵入性成像，这已被双光子显微镜（2PM）证明。此外，使用植入的玻璃窗结合先进成像技术可能彻底改变监测CNS中超昼夜振荡的能力。尽管如此，一个主要障碍依然存在：超昼夜振荡发生在几分钟到几小时的时间尺度上，需要高频、长时间的活体成像。为解决此问题，人工智能（AI）和数学建模可用于推断成像时间点之间的动态基因表达。例如，OscoNet框架可以从单细胞RNA测序数据中推断转录振荡器。最后，为了不仅观察而且操纵成年动物中的基因表达动力学，光遗传学方法正在快速发展，并可能提供强大的工具在体内诱导受控振荡。

总之，miRNA调控的转录因子表达超昼夜振荡对于神经系统的正常发育至关重要，它允许在静息、增殖和分化状态之间转换。Notch信号及其下游效应器的超昼夜动力学已成为成年CNS中干细胞静息的关键调控因子。然而，这些动力学对于响应损伤的神经系统修复的意义仍不清楚，解决这个问题需要在天然组织环境中对动力学进行活体成像。虽然超昼夜振荡的活体成像仍然是一个巨大的挑战，但新兴技术，包括高分辨率显微镜、光切换蛋白和AI驱动的分析，正在迅速发展，并有望显著推进我们对脊髓修复和动态基因调控的理解。