Lamtor1介导AMPK/mTOR双重激活：3D肌肉类器官揭示运动样收缩快速促进肌肉健康的新机制

《Advanced Science》：Muscle Organoids Reveal Exercise-Like Contractions Rapidly Promote Muscle Health Via Lamtor1's Signaling to Both AMPK and mTOR

本研究利用人胚胎干细胞构建3D骨骼肌类器官模型，首次揭示运动样电刺激收缩通过Lamtor1蛋白同时激活AMPK（脂代谢）和mTORC1（肌肉合成）信号通路的全新机制，为运动模拟疗法和代谢性疾病治疗提供了关键靶点。

　　

2.1 筛选诱导人骨骼肌肌管发现促肥大因子

研究团队采用转基因游离的化学限定方法，通过分阶段单层培养策略将人胚胎干细胞（hESCs）定向分化为诱导骨骼肌（iMusc）细胞。经过4天体节中胚层诱导、2天皮肌节祖细胞特化和7-27天骨骼肌祖细胞分化，获得PAX7⁺肌肉祖细胞。流式细胞术检测显示95%细胞表达CD56⁺/CD82⁺/CD201^-表型，最终分化为多核肌管表达MYOG和MHC。

通过高通量药物筛选约10,000种化合物，发现TGFβ抑制剂LY2157299（L）、IGF-1（I）和骨化三醇（C）对肌管肥大成熟具有最强效应。LIC组合显著降低肌祖细胞标志物PAX3和PAX7表达，同时强烈诱导肌球蛋白重链（MYHC、MYH2、MYH3、MYH7、MYH8）和骨骼肌特异性肌动蛋白（ACTA1、ACTN2）表达。Western blot证实LIC处理显著增加肥大标志物MHC蛋白表达，特别是运动诱导的慢缩肌MHC I型亚型。

2.2 3D iMusc类器官在LIC组合下显示增强的肌生成

将iMusc肌母细胞接种于纤维蛋白-基质胶混合支架上，成功构建长约3 cm的3D iMusc类器官。光片荧光显微镜显示类器官内存在密集排列的MHC⁺多核肌管，免疫荧光染色检测到肌营养不良蛋白表达。与成人原代骨骼肌母细胞（HSKM）相比，iMusc祖细胞形成的3D类器官具有更好的自组装效率。

定量蛋白质组学分析显示iMusc类器官富含胶原生物合成和糖胺聚糖相关的ECM蛋白，以及线粒体呼吸电子传递链和TCA循环蛋白。而HSKM来源的类器官则富含糖酵解酶、蛋白酶体亚基、炎症免疫信号和p53凋亡信号蛋白。功能实验表明LIC处理诱导最高的收缩耐力，产生约41 mN·mm^-2的特定颤搐力。

高分辨率成像显示LIC处理的类器官具有最丰富的α-辅肌动蛋白⁺横纹、Z盘和线粒体。RNA测序和GSEA分析证实LIC组合显著增强横纹肌收缩和PAX3基因靶标等肌生成转录特征，同时诱导IGF信号、抑制TGFβ信号，并协同上调核糖体、线粒体氧化磷酸化和Robo-Slit信号。

2.3 3D iMusc类器官收缩后快速诱导运动相关mRNA特征

电刺激 depolarization 诱导收缩1小时内即引起人肌肉转录组重大变化。GSEA分析显示电刺激快速上调钙-钙调神经磷酸酶-NFAT信号通路，验证NFATC2和PTGS2等靶基因表达。同时直接激活p38 MAPK信号通路，诱导肌因子IL-6和LIF、促再生serpin E以及转录因子CEBPD表达。

研究还发现电刺激直接上调表皮生长因子（EGF）-ErbB信号通路，包括EGF样因子和肌因子EREG、HBEGF，激酶TRIB1以及转录因子EGR1。神经生长因子（NGF）信号通路也被直接激活，包括肌因子BDNF和血清素生物合成酶TPH1。这些结果表明 depolarization 诱导收缩能直接快速诱导钙-NFAT、p38 MAPK、EGF-ErbB和NGF信号。

2.4 3D iMusc类器官收缩快速诱导运动样蛋白变化

蛋白质组学分析显示1小时电刺激收缩后，iMusc类器官和小鼠股四头肌中mTOR信号和胰岛素-PI3K-mTOR信号是最显著重叠的特征。Western blot分析证实收缩后磷酸化AMPK、AKT、4EBP和S6水平均增加，表明AMPK和mTORC1在肌纤维中同时激活。

研究发现运动迅速诱导Lamtor1蛋白表达，通过氨基酸敏感的Ragulator复合物提供激活mTORC1的替代路径。这解决了运动同时激活AMPK（分解代谢）和mTOR（合成代谢）的明显悖论，表明肌肉Lamtor1-AMPK直接激活为收缩肌肉快速提供能量，而Lamtor1-mTORC1在氨基酸存在下激活以促进肌肉生长和力量。

2.5 Lamtor1快速诱导对运动后mTOR介导的力量和AMPK介导的脂代谢至关重要

使用shRNA敲低Lamtor1后，iMusc类器官收缩幅度略微降低，磷酸化AMPK、S6和4EBP1水平降低。而过表达Lamtor1则增强收缩能力，提高磷酸化AMPK和mTORC1靶标水平。这些数据证实Lamtor1作为双向调节支架蛋白，能同时调控AMPK和mTORC1通路。

小鼠体内实验显示AAV9-shLamtor1处理显著降低肢体肌肉握力和肌纤维横截面积，同时增加空腹血糖和总血清胆固醇、性腺脂肪质量和脂肪细胞面积。Western blot显示肌肉中磷酸化AMPK和mTORC1靶标水平降低。Lamtor1敲低显著减少IIA型纤维，表明其对氧化表型的选择性调节。

人体活检分析显示老年人（65-76岁）肱二头肌Lamtor1表达显著低于年轻人（19-28岁），而年轻男性间歇运动训练后Lamtor1 RNA表达显著升高。这些发现表明运动诱导的Lamtor1对mTOR介导的合成代谢生长和AMPK介导的脂质分解代谢至关重要。

3 讨论

本研究建立的3D人iMusc类器官模型成功模拟体内运动肌肉的特征，具有>3 cm长度、肌节组装、≈41 kN·m^-2特定颤搐力，并包含PAX7⁺干细胞和SMA⁺/SOX9⁺基质，重现发育性肌生成的内源性细胞多样性。

研究解决了运动生物学中长期存在的谜团：运动诱导的mTOR信号（合成代谢）如何与AMPK信号（分解代谢）悖论性共存。发现通过诱导Lamtor1/Ragulator，为同时参与两条信号通路提供了机制解释。Lamtor1作为Ragulator复合物的核心支架蛋白，其功能扩展到运动生物学之外，间接控制自噬等细胞过程。

这些发现对于寻找治疗肌少性肥胖和代谢综合征的新肌肉药物具有重要意义，特别是在GLP-1类似物充斥肥胖药物市场的时代。AAV介导的针对Lamtor1等调节因子的基因治疗，可能对抗体重减轻治疗期间的肌肉消耗提供新的治疗策略。

4 实验方法

研究使用H1 hESC系，通过CHIR99021（GSK3b抑制剂）、LDN193189（BMP抑制剂）和LY2157299（TGFβR抑制剂）进行体节分化。PDMS模具中制备3D类器官，使用纤维蛋白-基质胶混合支架。电刺激参数为30 V、10 ms脉冲宽度、1 Hz频率。

蛋白质组学采用TMT标记、分级、LC-MS/MS分析。体内实验使用4月龄C57BL/6J小鼠，AAV9-shRNA肌肉注射剂量为1.65×10¹¹ v.g.颗粒。功能测试包括最大跑步能力测试、悬挂时间测试和握力测试。统计学分析采用双尾非配对Student's t检验或Welch's t检验。