PiP-Plex：一种用于多重定量分析单细胞分泌蛋白质的粒子间相互作用系统

《Advanced Materials》：PiP-Plex: A Particle-in-Particle System for Multiplexed Quantification of Proteins Secreted by Single Cells

本文提出了一种基于颗粒内封装和荧光编码微球的多蛋白单细胞分析系统PiP-plex。通过微流控技术将单个细胞与七种荧光编码微球（BMPs）封装在选择性渗透的 alginate 水凝胶颗粒中，结合共聚焦显微成像和三维图像分析，实现了单细胞水平的高灵敏度多蛋白分泌检测（检测限0.8-2000 pg/mL）。该技术保持了90%以上的细胞活力，支持细胞回收和后续分析。实验验证了PiP-plex在LPS刺激的THP-1巨噬细胞分泌MIP-1α、TNF-α和IL-17A等七种细胞因子上的高效性，并展示了与 bulk 测定方法的一致性。该技术为单细胞免疫应答研究提供了新工具。

　　在这项研究中，科学家们提出了一种创新的单细胞蛋白质分泌分析方法，称为PiP-plex。该方法结合了微流控技术和可渗透的藻酸盐水凝胶，以实现对单细胞分泌蛋白质的高通量、高灵敏度和高多重检测。传统方法在单细胞水平上检测分泌蛋白时面临诸多挑战，例如难以同时检测多种蛋白、检测过程可能破坏细胞活性以及难以实现细胞的后续分离和扩增。PiP-plex则通过将单细胞与多种荧光编码的微粒（BMPs）共同封装在水凝胶颗粒中，使单细胞能够在不被破坏的情况下释放蛋白质，同时允许对分泌蛋白进行多重分析。这种方法为研究细胞功能多样性提供了强有力的工具，尤其在癌症免疫治疗等应用中具有重要价值。

研究的核心在于构建一种新型的BMPs，这些微粒不仅携带了荧光编码，还功能化了针对特定细胞因子的捕获抗体（cAb）。通过微流控技术，科学家们能够将这些微粒与单细胞一起封装，形成一种“粒子-粒子”（PiP）系统。这种系统利用藻酸盐水凝胶的可渗透性，使得分泌的蛋白质能够扩散并被BMPs捕获。同时，水凝胶的结构有助于保持细胞活性，并为后续的细胞分离和扩增提供了可能。

为了提高检测的准确性，研究人员开发了一套基于共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）的图像处理流程。该流程包括对BMPs进行三维分割、解码其荧光强度编码以及量化分泌的细胞因子。由于藻酸盐水凝胶的透明性，PiP的边界在显微镜下并不明显，因此通过在缓冲液中添加大分子量的荧光染料（如FITC-葡聚糖），研究人员能够增强PiP与周围介质的对比度，从而实现更准确的图像分割。这种方法避免了传统荧光显微镜中可能存在的背景干扰，并允许对单个细胞和BMPs进行精确的定位和量化。

在实验过程中，科学家们对不同细胞因子的检测灵敏度进行了评估。他们发现，PiP-plex的检测限（LOD）在0.8 pg/mL至2 ng/mL之间，这表明该方法在单细胞水平上能够捕捉到非常低浓度的细胞因子。相比之下，传统批量检测方法的LOD通常更高，因此PiP-plex在灵敏度上具有明显优势。此外，研究还表明，通过藻酸盐水凝胶的封装，单细胞分泌的蛋白质能够被更有效地捕获，从而提高了检测的动态范围和信号强度。

在应用方面，研究团队使用了THP-1细胞作为模型，这些细胞在实验中被诱导分化为类似巨噬细胞的细胞。他们发现，PiP-plex能够准确检测到这些细胞在脂多糖（LPS）刺激下分泌的多种细胞因子，包括MIP-1α、TNF-α和IL-17A。这些细胞因子的分泌水平在刺激后显著增加，而某些细胞因子（如IL-17A）在刺激后成为最频繁分泌的细胞因子。这一结果表明，PiP-plex能够揭示细胞在刺激下的功能多样性，为免疫治疗中的细胞表型分析提供了新的视角。

此外，研究还评估了PiP-plex在不同细胞因子检测中的表现。例如，在检测IL-4时，PiP-plex的检测限比传统批量方法提高了50倍，而在检测MIP-1α时，检测限则有所降低。这一现象可能与细胞因子的等电点以及藻酸盐水凝胶的特性有关。例如，某些细胞因子可能与藻酸盐中的负电荷基团（如半乳糖酸）发生非特异性结合，从而影响检测的灵敏度和特异性。然而，PiP-plex的总体性能仍优于传统方法，尤其在保持细胞活性和实现多重检测方面。

研究团队还探讨了PiP-plex在不同实验条件下的稳定性。他们发现，通过使用藻酸盐水凝胶封装，PiP能够保持较高的细胞活性，使得细胞可以在实验过程中存活并进行后续的分离和扩增。这为研究细胞功能特性提供了更大的灵活性，使得研究人员可以在不破坏细胞的情况下，对分泌的细胞因子进行进一步分析。同时，该方法还允许对不同细胞类型进行封装，以研究细胞间接触和旁分泌信号对分泌的影响。

在数据分析方面，研究团队采用了多变量分析和聚类算法（如t-SNE）来揭示细胞分泌的多样性。他们发现，PiP-plex能够识别出多种细胞因子分泌模式，并且能够区分不同的细胞表型。例如，某些细胞在LPS刺激下表现出较高的细胞因子分泌能力，而另一些细胞则表现出较低的分泌水平。这种细胞因子分泌的多样性可能与细胞的功能状态、激活程度以及所处的微环境有关。

研究还讨论了PiP-plex在实际应用中的潜在优势。首先，该方法能够同时检测多个细胞因子，从而提高了检测的效率和信息量。其次，由于藻酸盐水凝胶的可渗透性，PiP-plex能够在保持细胞活性的同时，实现对分泌蛋白的捕获和分析。此外，该方法还能够实现细胞的后续分离和扩增，这在细胞治疗和免疫疗法中具有重要意义。最后，PiP-plex的图像处理流程能够自动解码BMPs的荧光强度编码，并准确量化细胞因子的分泌水平，从而提高了实验的可重复性和数据分析的效率。

然而，研究也指出了该方法的一些局限性。例如，由于BMPs的随机分布，部分PiP可能无法完全捕获所有细胞因子，导致数据缺失。为了应对这一问题，研究团队采用了数据插补方法，即使用同一样本中其他BMPs的平均信号值来填补缺失的细胞因子信号。此外，由于藻酸盐水凝胶的特性，某些细胞因子可能与水凝胶发生非特异性结合，从而影响检测的准确性。因此，未来的研究可能需要进一步优化水凝胶的成分，以减少非特异性结合并提高检测的特异性。

总的来说，PiP-plex为单细胞蛋白质分泌分析提供了一种新的方法，它结合了微流控技术、荧光编码和水凝胶封装，使得单细胞能够在不被破坏的情况下被分析，并且能够实现对多个细胞因子的检测。这种方法不仅提高了检测的灵敏度和动态范围，还为研究细胞功能多样性提供了新的工具。未来，随着技术的进一步优化和应用的拓展，PiP-plex有望在基础细胞生物学研究、疾病诊断和细胞治疗等领域发挥更大的作用。