健康人群DNA修复能力（DRC）个体差异的综合测量：揭示基因组稳定性与疾病易感性的新维度

本综述系统评述了利用荧光多重宿主细胞复活（FM-HCR）技术全面评估健康个体六种主要DNA修复通路（包括BER、NER、NHEJ、HR、MMR和MGMT通路）修复能力（DRC）的研究。研究揭示了DRC存在显著个体差异，且各通路间相关性较弱，强调了其在癌症及年龄相关疾病风险分层中的潜力，为精准医学提供了新工具和见解。

　　

2 结果

2.1 控制技术变异性提高FM-HCR重现性

研究首先探讨了样本处理和实验条件中产生的关键技术和生物学因素对FM-HCR读数的影响，包括批次效应、冷冻保存时间（CryoTime）、细胞数量（CryoAmount）、细胞活力和转染效率（TE）。批次效应是原始FM-HCR读值变异的主要来源，批次间变异系数（CV）范围为12.4%至45.7%，个体内CV范围为15.9%至46.5%。通过定制的分析策略，批次相关变异性被大幅降低，批次间CV平均减少74.0%，个体内CV减少31.5%。同一个体的重复测量值更加聚集，平均CV从20.1%降至16.7%，表明重现性得到改善。混合的技术-生物学变量（CryoAmount、细胞活力和TE）在调整后与DRC仍存在适度的、通路特异性的关联，这进一步解释了剩余的个体内变异。这些发现强调了样本处理一致性和在统计模型中纳入样本特异性技术及生物学参数的重要性。

2.2 DNA修复能力的个体间差异

在10种报告基因检测中观察到显著的个体间差异。DRC的相对全景图与人口统计学数据一同呈现。探究观察到的个体间差异的影响因素，发现人口统计学因素，包括年龄、种族和吸烟状况，均独立影响一个或多个通路的修复能力。调整多个协变量后，观察到A:8oxoG修复能力随年龄增长而下降（估计每10年增量下降0.2个标准差）。种族与数个通路的DRC差异相关，包括Hx:T、A:8oxoG、MMR、NHEJ、MGMT和NER。吸烟与观察到的LP-BER修复减少相关（当前吸烟者与从不吸烟者相比：估计值 = -0.83个标准差），但在多重检验校正后显著性减弱。

2.3 DNA修复通路间的共调控与竞争

在56名参与者首次就诊时收集的数据中观察到DRC之间存在一些相关性。测量BER起始步骤的U:G与Hx:T报告基因检测（Pearson R = 0.35）以及U:G与8oxoG:C报告基因检测（Pearson R = 0.42）之间的正相关，提示DNA糖基化酶可能存在共调控。长链BER（LP-BER）与通过U:G报告基因检测（Pearson R = -0.30）和Hx:T报告基因检测（Pearson R = -0.66）测量的BER起始呈负相关，表明在糖基化酶活性较高的刺激T淋巴细胞中，长链BER活性较低。NER与若干其他通路活性（Hx:T、MMR、HR、MGMT）相关，但与NHEJ负相关。最后，MMR与HR（Pearson R = 0.39）和NER（Pearson R = 0.47）正相关，与NHEJ负相关（Pearson R = -0.52），这与细胞周期调控 favoring MMR和HR在S期和G2M期，而NHEJ在G1期占优势是一致的。MMR、NER、HR和NHEJ可能是共调控的，NHEJ与其他通路之间的反向关系表明它们竞争相同的底物。

2.4 FM-HCR测量的DRC与彗星实验测量的修复动力学之间的关系

先前报道的用于修复过氧化氢（H₂O₂）诱导的DNA损伤的CometChip数据被重新分析，以评估批次校正的有效性和使用贝叶斯模型拟合算法对10名具有重复测量的参与者的半衰期估计值的个体内CV。与传统非线性最小二乘法（NLS）相比，贝叶斯算法将批次校正前重复测量的变异从49.5%降低到33.2%，批次校正后从28.6%降低到23.1%，表明批次校正和贝叶斯算法的结合可以提高DRC估计的准确性和稳健性。与FM-HCR的发现类似，对于CometChip数据，观察到个体间变异性大于同一个体内的测量变异性。

56名参与者首次就诊时的DNA修复动力学按修复速率（以半衰期表示）排名，并与相应的人口统计学和DRC数据相互印证。修复动力学在年轻参与者中表现出更大的异质性，非常快或非常慢的修复动力学更常见。在12名40岁及以上的参与者中，只有4人修复动力学慢，没有人被归类为修复非常慢。虽然发现年龄与半衰期之间存在统计关联（p = 0.0285），但各年龄组的修复动力学分布并未遵循一致的线性模式，表明这种关系可能比简单的年龄依赖性趋势更复杂。有趋势表明种族和吸烟状况存在差异动力学，但关联未达到统计学显著性，可能由于样本量不足。

DRC与损伤水平和修复动力学之间的相关性如图所示。发现MGMT与H₂O₂处理后的初始损伤水平呈负相关（0分钟时Spearman R = -0.50），而Hx:T和NER与后期时间点的损伤水平负相关（Hx:T在30分钟时Spearman R = -0.42；NER在60分钟时Spearman R = -0.45），LP-BER与损伤水平正相关（15分钟时Spearman R = 0.38）。Hx:T修复诱导的DNA损伤50%所需的时间（t_1/2）之间存在负相关（Spearman R = -0.39），表明对于Hx:T损伤修复更有效的个体，其修复动力学更快。相比之下，整体（t_1/2）和快速（t_1/2 fast）相修复动力学与LP-BER均呈正相关（两个半衰期估计值的Spearman R = 0.41），表明H₂O₂诱导的DNA损伤修复速率与LP-BER修复THF损伤的效率之间存在反向关系。

3 讨论

3.1 个体内稳定性与个体间差异

研究设计包括重复测量，从而能够评估FM-HCR测量的DRC在短采样期内是否足够稳定，以便对个体间差异得出有意义的结论。确实，在所有DRC检测中观察到显著的个体间变异性，与4-6周内相对的个体内稳定性形成对比。在MUTYH（A:8oxoG）修复活性中观察到的38.1%群体CV是显著的，考虑到MUTYH在响应氧化性DNA损伤中的关键作用，以及即使在携带单个无活性等位基因的个体中，MUTYH相关息肉病（MAP）风险也会增加。观察到的MUTYH个体间差异反映了可能受遗传变异、基因表达或翻译后修饰影响的修复效率谱。

NHEJ中观察到的微小个体间差异（群体CV = 8.8%）可能是该通路修复相对较快间接结果。相比之下，HR较高的变异性（群体CV = 33.9%）可能反映了细胞周期依赖性调控的生物学变异：NHEJ几乎仅在静止细胞中使用，而HR在细胞增殖期间活跃。

与先前使用 Epstein-Barr 病毒转化的 B 淋巴母细胞系（LCL）的研究比较表明，一些通路（如 A:8oxoG 修复和 NER）在原代细胞和 LCL 中表现出相当的变异性，而其他通路，特别是 MGMT 活性，则存在显著差异。MGMT 活性在原代淋巴细胞中普遍较高，而在 LCL 中则高度可变。MGMT 在癌症中的沉默早已为人所知，但这些发现表明它可能在致癌背景之外的永生细胞中发生。这些数据强调了在原代细胞中验证关于人类变异的发现的重要性。

与现有研究相比，本研究观察到的个体间变异性普遍较低。然而，MGMT 修复活性的高变异性与先前在无细胞提取物和人类器官中的报道一致。FM-HCR 观察到的高 CV 可能部分受到某些检测中由于报告基因表达极低（原始数据中约 0.00749%）而导致的零信号的影响。

3.2 人口统计学变量与DRC之间的关联

先前的研究表明DRC受环境、遗传和年龄的影响。在线性混合效应模型的探索性分析中，发现BER能力与年龄之间存在显著的负相关关系，特别是A:8oxoG修复能力，而在调整协变量后，8oxoG:C修复能力的下降关联仍处于临界状态。最近的研究表明MUTYH依赖的A:8oxoG修复和OGG1依赖的8oxoG:C修复都会影响端粒长度。虽然这些观察结果引人入胜，但我们的发现应被视为初步和产生假设的；需要未来的工作来确定BER能力是否与人群中的端粒长度相关。虽然先前的工作报道了细胞和组织中NER和MMR与年龄相关的下降，但在我们的队列中没有观察到这种减少。我们队列相对年轻的年龄（平均年龄28岁）可能限制了我们检测其他研究中报道的与年龄相关下降的能力。

虽然我们的样本量不足以研究种族与DRC之间的关联，但在几个DNA修复通路中观察到了一些初步关联，包括BER通路（Hx:T, A:8oxoG）、MMR和NER。关于种族多样性的先前文献主要集中在跨种族群体的基因组变异上，并且仍然相对较少的研究包含反映健康差异环境驱动因素的功能测量。我们的主要发现应谨慎解释，因为它们可能反映潜在的社会或环境因素，并且需要在更大、更多样化的队列中进行验证。

3.3 DNA修复通路之间的相关性

虽然DNA修复通路之间存在一些相关性，但我们数据中最显著的趋势是DNA修复通路之间缺乏强相关性。FM-HCR报告基因检测先前已在修复缺陷细胞系中得到严格验证。该验证反复确认，每个检测报告特定通路的DRC，并且以独立于其他通路缺陷的方式报告，除非两个或更多通路竞争相同的DNA损伤（例如，HR和NHEJ竞争修复双链断裂）。尽管不能完全排除技术偏差来源，但报告基因检测之间的相关性可以合理地假设反映了修复活动的共调控。

总体而言，所有通路之间缺乏强相关性凸显了DNA修复机制的复杂性和特异性，并强调了独立监测每个通路的重要性。这种独立评估提供了关于通路特异性功能、通路间串扰以及控制DNA修复的调控网络的丰富信息。

3.4 FM-HCR与彗星实验测量的DNA修复动力学之间的关联

尽管CometChip和FM-HCR在不同的时间尺度上运行并处理不同类型的DNA损伤，但我们试图识别它们之间的关联，这可能有助于强化对我们数据集的解释。CometChip在t₀时测量的基因组DNA损伤水平反映了BER起始（增加链断裂数量）和修复完成（减少链断裂数量）的综合效应。氧化碱基损伤和无碱基位点的低效处理可能导致由于BER中间产物的积累而出现持续的DNA损伤，而具有更高效BER系统的细胞在t₀之前就解决了这些中间产物。H₂O₂诱导的氧化碱基修复主要通过LP-BER进行，但我们观察到LP-BER能力与更高的损伤水平和延迟修复之间存在关联，表明LP-BER活性增加导致H₂O₂诱导的DNA损伤整体修复更慢。

我们观察到的t_1/2与NER之间的负相关关系与其在修复某些类型的H₂O₂诱导的DNA损伤中所报道的作用一致。虽然修复Hx:T的糖基化酶所修复的烷基损伤不是H₂O₂诱导的氧化损伤的主要产物，但我们观察到Hx:T修复与DNA损伤水平和修复速率均存在显著的负相关。AAG活性（通过Hx:T检测测量）与H₂O₂诱导的DNA损伤分辨率之间的这种明显关联可能反映了脂质过氧化后产生的乙烯加合物的修复。

此外，MGMT活性与H₂O₂诱导的DNA损伤初始水平呈负相关。由于MGMT不直接修复H₂O₂诱导的损伤，这种相关性暗示了一种间接联系。值得注意的是，一些研究报告了MGMT水平与抗氧化剂谷胱甘肽之间的关联，谷胱甘肽可防止过氧化物诱导的DNA损伤。

3.5 局限性与未来研究方向

我们承认研究中存在几个局限性，这些局限性也突出了未来研究的机会。首先，我们分析了PHA刺激的淋巴细胞，其DRC可能与静息淋巴细胞不同，并且可能不代表其他组织类型。未来的工作应比较刺激和静息淋巴细胞，并将分析扩展到其他细胞和组织类型。其次，基于质粒的报告基因可能不能完全重现染色质环境；然而，我们先前的工作表明FM-HCR质粒可以在染色质免疫沉淀检测中回收，并在染色质重塑蛋白 disruption 时捕获修复活动的变化。第三，我们的队列主要由具有高社会经济地位的年轻人组成，限制了普适性。第四，我们的重复测量仅覆盖4-6周，证明了短期重现性，但未包括长期或与年龄相关的变异。最后，虽然我们的研究证明了DRC中存在显著的个体间变异，但它并未整合多组学（遗传、转录组和蛋白质组）数据或直接建立与临床结果的联系。

3.6 新颖性与意义

我们的研究结果对DNA修复和精准医学领域有几个重要的启示。我们方法的一个特别显著的优势是包含多个互补的功能检测来表征DNA修复能力。这种方法通过FM-HCR全面分析了六种主要通路的DNA修复能力，并结合了我们先前报道的通过CometChip对相同个体淋巴细胞中基因组DNA修复的分析。

本研究中标准化和验证的检测及统计分析可以作为人类研究中DRC测量的敏感基准。通过证明可重复检测细微的个体间差异，我们的研究确立了将FM-HCR整合到更大规模分子流行病学研究的可行性， potentially uncovering previously unrecognized associations between DNA repair, disease risk, and health outcomes。

4 实验部分

研究参与者

该研究在马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院临床研究中心招募了56名健康志愿者。其中10名志愿者参与了一项重复测量研究，在4-6周内采集4-5份血液样本。其余46名参与者接受单次抽血。在入组时使用问卷收集人口统计学信息，包括年龄、性别、种族、身高、体重、吸烟史、饮酒、癌症家族史和出生地。

样本处理

本研究血液样本处理、冷冻保存、复苏和培养如前所述。通过标准Ficoll梯度密度离心从新鲜全血的血沉棕黄层中获得PBMCs。将每个参与者的PBMCs在冷冻培养基中以至少5x10⁶个细胞每管冷冻保存于1mL等分试样中。

研究流程与实验设计

本研究的主要目的是评估FM-HCR检测在检测DRC个体间差异方面的敏感性，并评估DRC的短期个体内稳定性。实验设计旨在评估和区分生物学变异与样本处理和实验条件产生的技术变异。

FM-HCR检测

使用10种针对特定DNA修复通路的报告质粒通过FM-HCR测量DRC。FM-HCR检测的详细方法如前所述。简要来说，FM-HCR检测量化了细胞修复引入报告质粒的特定类型DNA损伤的能力，修复效率通过荧光报告基因的表达水平反映。

数据预处理

开发了用于FM-HCR在人群研究中应用的标准化数据处理流程。为减轻异常值影响并实现标准化，首先对原始报告基因表达数据进行自然对数转换。对于五种报告基因检测（即U:G、Hx:T、8oxoG:C、A:8oxoG、MGMT），较高的报告基因表达对应于较低的DRC，因为荧光信号是由未修复DNA损伤诱导的转录错误产生的。

彗星动力学建模

CometChip检测与FM-HCR并行进行，遵循相同的实验设计，并先前已详细描述。在本研究中，应用了前述批次校正后重新审视了DNA修复动力学数据。还通过采用贝叶斯推理方法来估计模型参数的后验分布，增强了动力学模型拟合，这减少了传统NLS算法可能产生的不稳定估计的影响。

统计分析

两名参与者（3.6%）年龄数据缺失，四名参与者（7.1%）缺失计算BMI所需的身高或体重测量值。为维持统计效力并最小化偏差，在假设数据“随机缺失”（MAR）的情况下进行了多重插补。使用线性混合效应（LME）模型来检测DRC中的个体间差异并探索影响因素。