大麻蛋白与绿茶多酚共轭构建新型植物源纳米乳剂用于负载亲脂性精神药物的递送系统

本综述创新性地报道了一种由大麻蛋白（HP）与绿茶多酚（GTP）通过共价（HP–GTPcov）和非共价（HP–GTPnoncov）结合构建的新型生物相容性乳化剂，成功制备了负载5-甲氧基-N,N-二甲基色胺（5-MeO-DMT）的纳米乳剂（NEs）。该递送系统平均液滴尺寸约200 nm，ζ电位约-40 mV，具有卓越的胶体稳定性、抗氧化保护特性及增强的细胞摄取能力，为改善难溶性精神药物的生物利用度及精准给药提供了创新解决方案。

　　

2.1 新型乳化剂的表征

通过光谱学和热分析方法对共轭物进行了系统表征。红外光谱显示，非共价结合物在1350 cm^-1附近出现酚类伸缩振动峰，而共价结合物因氢氧化钠催化氧化形成醌类，该峰强度减弱。热重分析表明，共轭物的热稳定性低于天然大麻蛋白，水分损失阶段提前50°C结束，且在200–250°C区间质量损失更大，这与绿茶多酚的热行为一致。紫外-可见光谱显示，天然大麻蛋白在280 nm处有弱吸收峰，绿茶多酚在350 nm有强吸收峰，共轭物中该峰强度降低。荧光光谱显示，共轭物荧光强度显著降低且发生红移，表明色氨酸等荧光团参与了结合过程，且蛋白三级结构发生去折叠。圆二色谱分析表明，共轭物在210和225 nm处出现负信号，190 nm以下出现正信号，提示其二级结构以β-折叠为主，与天然蛋白相比，反左手扭曲β-折叠的比例有所增加。

2.2 乳化活性与稳定性指数表明胶体稳定性

乳化活性指数（EAI）分析显示，HP–GTP_noncov和HP–GTP_cov的EAI值分别为104.6 ± 18.7 m²·g^-1和94.2 ± 6.7 m²·g^-1，远高于典型蛋白质的20–30 m²·g^-1。乳化稳定性指数（ESI）方面，HP–GTP_cov为228.2分钟，HP–GTP_noncov为120分钟，均优于此前报道的蛋白质乳液。

2.3 HP–GTP共轭物具有强效抗氧化活性

DPPH自由基清除实验表明，天然绿茶多酚的IC₅₀为65 μg·mL^-1，而天然大麻蛋白无活性。新制备的HP–GTP_noncov和HP–GTP_cov的IC₅₀值分别为227和226 μg·mL^-1。与某些植物提取物（如T. pallida leaves, IC₅₀ = 9.2 μg·mL^-1）或木瓜蛋白酶水解物（IC₅₀ = 30400 μg·mL^-1）相比，该乳化剂显示出中等的自由基清除能力。

2.4 5-MeO-DMT纳米乳剂的表征与应激响应分析

2.4.1 新鲜乳剂的指纹图谱

粒径分析表明，所得纳米乳剂（NEs）液滴平均尺寸小于250 nm，多分散指数（PDI）低至中等，ζ电位绝对值高于30 mV，表明乳液具有高度稳定性。扫描电镜（SEM）图像显示，共价和非共价共轭物乳液均形成结构清晰的液滴，而对照组（5-MeO-DMT溶于大麻油并稀释于己烷）则呈现数十微米大小的模糊团块。动态光散射（DLS）测得的尺寸略大于SEM结果，这是软纳米结构在SEM制样过程中干燥导致的常见现象。

2.5 纳米乳剂对5-MeO-DMT具有中等包封效率与载药量

新鲜制备的纳米乳剂中，非共价共轭乳液（NCCE）和共价共轭乳液（CCE）的包封效率（EE）分别为57.9 ± 2.2%和64.9 ± 1.8%，载药量（LC）分别为17.6 ± 0.54%和21.6 ± 0.46%。鉴于5-MeO-DMT的计算logP值约为1.68，其在水相和油相中均会有一定分配。

2.6 纳米乳剂在4°C储存下稳定

在4°C下储存一个月，两种配方中的API（活性药物成分）稳定性均未发生变化，颗粒尺寸和多分散指数（PDI）也未出现显著增加。未观察到可见的相分离、絮凝、乳析、沉降或其他乳液失稳现象。

2.7 纳米乳剂能抵抗多种物理和化学应激源

热处理仅轻微增加平均液滴尺寸和PDI，但冷冻-解冻循环会导致液滴尺寸增加十倍且PDI急剧上升。化学添加剂测试中，蔗糖（最高500 mM）和离子型防腐剂山梨酸钾对两种乳液的粒径均无影响。添加二价阳离子CaCl₂（10 mM）会立即破坏CCE的稳定性，导致颗粒聚集至>5 μm，这归因于Ca²⁺减少了液滴间的德拜屏蔽长度，使吸引力占主导。然而，NCCE未观察到此效应，仅分散度有所增加。

pH变化测试表明，在极端pH（1和11）下，两种配方均未发生相分离，但会导致5-MeO-DMT发生化学降解。CCE在pH 11下未出现API降解，而NCCE和未配方API（溶于乙醇）的降解率分别为28%和36%。CCE的平均液滴尺寸从203.6 nm（pH 8.7）变为376.8 nm（pH 3）；NCCE除在pH 1时粒径从200.2 nm（pH 9.8）增至245.4 nm外，在其他pH下胶体稳定性无显著变化。

2.8 添加剂的影响

化学添加剂对纳米制剂的稳定性有深远影响。然而，添加高达500 mM的蔗糖对NCCE和CCE的粒径均无影响。离子型防腐剂山梨酸钾的添加也未产生影响。添加CaCl₂旨在模拟硬水稀释或必需矿物质添加的效果。添加二价阳离子通常会导致含有带电乳化剂的纳米乳剂不稳定和相分离。此效应在CCE中观察到：粘附性增加，稠度变厚，可能源于阳离子与乳化剂上电荷的桥联相互作用。添加10 mM CaCl₂后，CCE立即失稳，颗粒聚集至>5 μm。主要原因在于Ca²⁺减少了液滴间的德拜屏蔽长度，从而降低了液滴间斥力。若此效应足够强，液滴会靠近至范德华力等吸引力占主导，导致液滴 coalescence 和/或絮凝。此多价阳离子添加剂效应在ζ电位高于25 mV的乳液中尤为显著，本文情况即是如此。此效应在NCCE中未观察到，但注意到分散度有所增加。

2.9 动力学释放研究

动力学释放研究旨在评估5-MeO-DMT从制剂中释放的速率，并探索其可能的释放机制。150分钟后，CCE和NCCE分别释放了70%至100%的药物总载量，而未配方API混悬液在420分钟后释放不足15%。该制剂并非缓释制剂：释放动力学明显受扩散限制。然而，这未必是问题。迷幻药物通常以未配方形式使用以求快速起效，尽管缓释微剂量制剂可能适用于某些应用，但快速释放可能更适用于精神健康适应症。

为确定确切的释放模式，应用了多种动力学模型（零级、一级、Higuchi、Korsmeyer-Peppas和Hixson-Crowell）。根据“拟合优度”参数，这些实验中最可能的API释放机制似乎是5-MeO-DMT在数分钟内从NEs中快速释放，随后API通过透析膜的扩散受限 traversAL，Higuchi模型的高R²值（CCE为0.988）证明了这一点。这与SNEDDS（自纳米乳化药物递送系统）加载胶囊中常见的机制形成对比，后者是溶剂扩散至胶囊壳内部诱导壳层松弛，随后NE solubilization 和药物释放。对于CCE和NCCE，在30分钟时，累计药物释放已达约50%。这再次表明API从NE液滴内快速/“突释”释放，随后向外部介质的累计释放速率与时间的平方根（√t）呈线性关系。这表明释放速率源于5-MeO-DMT跨膜缓慢扩散及其在溶出介质中的低溶解度（<10 mg?mL^-1）。我们假设，即使NE解体后，掺入油相的药物释放仍需时间。API释放数据的高度线性[R² = 0.963；CCE的k₀ = 0.34 h^-1]意味着5-MeO-DMT分子从透析袋内线性释放。零级释放曲线是药物通过膜进行Fickian扩散的直接结果。我们推测，透析袋外API的初始快速积累（最终会减慢）可能部分源于部分NE携带API穿过透析膜。然而，NE液滴在透析袋内迅速降解，5-MeO-DMT穿越膜屏障的效率随之降低，因其对应于扩散受限过程。相比之下，未配方API仅在袋中沉淀且不以任何有意义的速度溶解。

2.10 纳米乳剂可减轻5-MeO-DMT的毒性

与所有分子一样，5-MeO-DMT在足够高的剂量下具有毒性，尽管据我们所知，从未有单独使用该药物导致人类死亡的报道。5-MeO-DMT在小鼠中的LD₅₀估计在48–278 mg·Kg^-1之间；高热、共济失调和惊厥归因于该药物的毒性。成人通过热蒸气吸入或静脉注射的5-MeO-DMT活性剂量为1–5 mg，允许较宽的治疗窗。然而，我们希望确定NEs是否能保护细胞免受药物的影响，正如它们保护药物免受外部应激源一样。这将表明纳米 encapsulation 可能进一步拓宽治疗窗。

我们检测了两种NE系统相对于未配方5-MeO-DMT在三种不同人类癌细胞（MDA-MB-231、U87胶质母细胞瘤（GBM）和U251（GBM）——以确定对脑细胞的细胞毒性效应，因为该药物的靶受体在神经元上表达）和非癌性大鼠肺细胞（L2——以确定对健康细胞系的细胞毒性效应）中的浓度依赖性细胞毒性。对于所有细胞系，NEs的毒性均低于未配方药物。采用普遍接受的80%存活率为无毒阈值，NEs仅在U251 GBM细胞系中于275 μg·g^-1浓度下显示毒性。配方中使用GRAS（一般认为安全）成分确保我们可预期无辅料引起的偶然毒性。未配方药物在所有细胞系的最高浓度下均显示毒性。关于NEs减轻5-MeO-DMT毒性途径的进一步研究正在进行中。

2.11 纳米乳剂促进5-MeO-DMT进入人类细胞

我们已经证实NEs保护API免受加工和储存过程中可能遇到的物理应激源，并表明它们克服了5-MeO-DMT的溶解度和生物利用度问题，但配方的第三个主要原因是协助穿越血脑屏障（BBB），这对任何中枢神经系统活性剂都至关重要。这可通过简单的细胞摄取研究来建模。极性化合物穿透细胞膜进入活细胞需要化学支持，例如配方中使用的辅料或细胞穿透肽；这对于治疗性精神活性而言更为重要。为可视化该过程，将尼罗红与5-MeO-DMT共同包裹在NE内。结果表明，CCE和NCCE配方通过荧光成像在U87胶质母细胞瘤（GBM）细胞膜内递送了迷幻药物 payload，通过检测细胞壁内的荧光团（尼罗红）得以证实。为进一步确认NEs的细胞摄取，通过共聚焦激光扫描显微镜评估了它们的共定位。细胞骨架（绿色区域）内和细胞核（蓝色区域）周围出现的橙色是NEs进入两种GBM细胞系的证据。该数据与荧光显微镜图像一致。

NEs是生物相容性载体，能够显著改善难溶性API（如5-MeO-DMT）的摄取和生物活性。使用HP–GTP_noncov和HP–GTP_cov具有若干优势，包括增强的溶解度、稳定性和细胞摄取；此外，已知天然多肽可作为穿梭体， enabling 多种小分子跨越BBB的流入。平均液滴尺寸 under 200 nm的NEs显示可增强生物活性 payload（如紫杉醇、坎地沙坦酯、姜黄素、槲皮素和白藜芦醇）的细胞摄取和生物利用度。最近的综述强调，这种摄取活性并不依赖于所谓的增强渗透性和滞留效应（EPR effect），尽管文献中有此 justification，但已确证在人类中并非有意义的机制（尽管在啮齿类动物中存在）。需要进一步的体内或离体研究来评估NEs穿越血脑屏障（BBB）并向大脑递送精神治疗药物的能力。

3 结论

功能化DMT-based迷幻药物是治疗影响大脑和神经系统的多种疾病的最新药物 additions。针对克服迷幻药物以剂量控制形式给药的局限性的配方设计，进行的研究甚少（或至少已发表的很少）；事实上，根据已注册的临床试验，行业似乎未考虑需要转向纳米 encapsulation 以确保特定剂量的受控递送。我们具有抗氧化特性的 de novo 乳化剂形成了稳定、稳健的5-MeO-DMT配方。这些药物递送载体不仅保护API免受氧化降解，还导致高细胞摄取并降低API的细胞毒性。这些具有次级抗氧化特性的NEs可能易于定制用于口服、经颊以及鼻内递送，为精神药物提供简单的给药途径，并因其易用性、舒适性和成本效益而有利于患者依从性。然而，这些配方对于体内应用的适用性未在本文中检验，仍是本工作的一个局限。为确定首选给药途径，需要进行体内评估。还需要体内测试来量化NCCE和CCE提供的增强生物利用度，以及它们通过提供增强的药物 brain access 相对于游离药物治疗神经精神疾病的能力。这是关于纳米科学和技术在精神活性API靶向递送中应用的系列报告中的第一篇。这些新颖的乳化剂充当“特洛伊木马”，将API payload 携带至未配方API无法进入的细胞内目的地。我们希望这些配方最终将使患有心理健康疾病的脆弱人群受益，因为科学界正在重新审视色胺及其衍生物作为一类常被忽视的药物。