空间转录组与单核RNA测序揭示CAF构建肝癌双重基质-免疫屏障的缺氧代谢肌成纤维细胞（hmmyCAFs）核心作用

本研究整合单核RNA测序（snRNA-seq）与空间转录组（stRNA-seq）技术，揭示肝癌微环境中缺氧代谢肌成纤维细胞（hmmyCAFs）通过物理屏障（胶原沉积）、分子调控（POSTN介导免疫检查点抑制）和代谢重塑（缺氧驱动糖酵解）三重机制构筑免疫抑制微环境，为靶向CAF改善免疫治疗耐药提供新策略。

　　

引言

肝细胞癌（HCC）作为全球癌症相关死亡的第三大原因，表现出深刻的空间异质性，导致治疗抵抗。尽管免疫检查点阻断（ICB）疗法如抗PD-1/L1抗体取得进展，但超过90%的死亡归因于转移或难治性疾病。癌症相关成纤维细胞（CAFs）在塑造免疫抑制微环境中的作用尚未完全明确。本研究通过整合单核RNA测序（snRNA-seq）和空间转录组学（stRNA-seq），旨在绘制HCC的细胞和分子景观，揭示CAFs在空间上调节CD8?? T细胞分布和功能的机制。

结果

snRNA-seq数据揭示HCC的细胞组成

通过分析22,8045个细胞和43684个基因，识别出11种细胞类型，包括肝细胞、成纤维细胞、肥大细胞、肝窦内皮细胞（LSEC）、T_NK细胞（T细胞和NK细胞的混合亚群）、内皮细胞、髓系细胞、B细胞、浆细胞和树突状细胞（DCs）。成纤维细胞与LSEC和内皮细胞共同构成HCC基质的主要细胞群。空间解卷积显示成纤维细胞和髓系细胞在侵袭前沿区域选择性富集。

HCC的空间转录组特征

空间聚类鉴定出14个组织域。基因本体（GO）富集分析显示，与相邻非肿瘤区域相比，肿瘤区域内转录/翻译活性、增殖信号、氧化磷酸化和免疫激活显著增强。成纤维细胞富集群表现出与抗原加工和呈递以及脂肪酸代谢过程相关的通路上调，强调了它们在HCC微环境中的代谢和免疫调节作用。

HCC中的可变免疫抑制

评估三种不同免疫功能基因集的表达谱，即共刺激、细胞毒/效应和共抑制/耗竭。共刺激基因在先天和适应性免疫细胞中表达，特别是在CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞中。细胞毒/效应基因主要由T和NK细胞表达，在stRNA-seq定义的侵袭前沿和肿瘤核心区域显著上调。免疫检查点基因CTLA4和PDCD1（PD-1）在stRNA-seq数据中未检测到显著表达，尽管snRNA-seq在Tregs、T和NK细胞中鉴定出稳健表达。DC表达的基因（如IDO1和LGALS9）已知可抑制细胞毒T细胞活性，表明它们作为HCC免疫治疗替代免疫检查点靶点的潜力。

肿瘤的能量代谢状态与不同的免疫反应相关

对四种代谢相关通路进行基因集变异分析（GSVA）：缺氧、糖酵解、戊糖磷酸和脂质代谢通路。根据复合GSVA评分将肿瘤分层为代谢表型——前20%评分区域指定为高代谢簇，后20%构成低代谢簇。高代谢区域表现出显著的氧化磷酸化（OXPHOS）、糖酵解通量和乳酸产生激活，这是增殖肿瘤群体中Warburg效应的特征。这些区域同时表现出缺氧信号和脂质代谢活性升高，表明快速生长肿瘤中代谢应激的补偿反应。低代谢区域显示内皮细胞和T_NK细胞显著富集，表明先天免疫激活。相反，高代谢区域被免疫抑制群体浸润，包括浆细胞和癌细胞，表明适应性免疫受损。代谢状态的空间异质性在两个病例（HCC4和HCC1）中明显，其中相邻的高代谢和低代谢簇共存于个体肿瘤内。这种肿瘤内代谢分区可能反映了驱动进化适应的独特微环境压力，对针对代谢检查点的精准免疫治疗策略具有潜在意义。

HCC中缺氧代谢癌症相关肌成纤维细胞（hmmyCAFs）的特征

代谢肿瘤区域的空间分析揭示了高代谢区域外围的基质带状结构，促使对成纤维细胞群体进行snRNA-seq分析。鉴定出4762个CAFs，其中一个亚群表现出细胞外基质（ECM）相关基因（如COL6A3、COL5A1）在肿瘤样本中相比正常组织显著上调。代谢通路活性分析发现该亚群在缺氧、糖酵解、戊糖磷酸化和脂质代谢等通路中高表达。基于这种促纤维化转录特征和高代谢特性，将该簇命名为代谢肌成纤维细胞（myCAFs）。观察到预期比率（Ro/e）计算显示代谢myCAFs具有显著的肿瘤特异性富集（Ro/e = 2.7，p = 3.1 × 10^?5），超过随机分布预期。MSigDB标志分析显示代谢myCAFs中双重通路激活：1）基质程序，包括UV反应抑制、血管生成和EMT调节；2）致癌信号，包括p53/KRAS通路调节、细胞周期控制（G2/M检查点、E2F靶标）和雌激素反应。转录组上，这些细胞维持胶原生物合成机制（COL1A1/3A1/4A1/5A2/6A3）同时异常表达增殖标志物（TOP2A、MKI67），表明它们通过结合基质沉积和自我更新能力在微环境重塑中的积极作用。 progeny R包计算肿瘤通路活性评分显示，在成纤维细胞亚群中，代谢myCAFs选择性富集缺氧通路活性，特征为缺氧诱导因子靶标的协调上调，最终将该myCAFs命名为缺氧代谢肌成纤维细胞（hmmyCAFs）。肿瘤侵袭前沿区域的myCAFs与缺氧代谢呈显著正相关（Spearman rho = 0.53，p < 0.001）。免疫荧光（IF）验证了组织中POSTN的表达。

hmmyCAFs可能从多方面促进HCC的生长和转移

为了定位hmmyCAFs在StRNA-seq芯片中的空间分布，采用RCTD分析方法整合snRNA-seq和StRNA-seq数据。结果显示hmmyCAFs在4个stRNA-seq幻灯片中的2个中富集在一些肿瘤区域周围。IHC染色使用来自相同样本的连续组织切片进一步证实了hmmyCAFs在HCC中的存在。值得注意的是，并非所有肿瘤区域都被hmmyCAFs包围，这引发了与这些细胞存在相关的生物学差异的好奇。为了全面阐明hmmyCAFs在HCC中的生物学功能，根据转录组数据中hmmyCAFs的空间分布密度将肿瘤区域分为两类：hmmyCAF高肿瘤区域和hmmyCAF低肿瘤区域。hmmyCAFs的存在由RCTD方法和POSTN表达模式共同确定。然后使用四个样本的hmmyCAF+和hmmyCAF–肿瘤区域之间的差异表达基因进行GO富集分析。结果显示hmmyCAF+肿瘤在体液免疫反应、补体激活和炎症反应补体激活方面比hmmyCAF–肿瘤更活跃。同时，核糖体、细胞质和类固醇代谢过程在hmmyCAF+肿瘤中下调。这些观察结果与HCC的免疫和代谢异质性一致。这些结果表明hmmyCAFs的存在可能从不同方面支持肿瘤进展。接下来，计算肿瘤区域的免疫基因集的基因模块表达评分以评估免疫细胞丰度。结果显示hmmyCAF+肿瘤中B细胞、肥大细胞和DCs的数量显著减少，表明hmmyCAFs可能作为物理屏障阻止促免疫细胞浸润到肿瘤区域。为了证实这一点，进行了mIF以测量hmmyCAFs、CD4+细胞和CD8+细胞的空间分布，分别使用POSTN、CD4和CD8作为标志物。结果显示CD4+和CD8+细胞在由hmmyCAFs包围的肿瘤外部积累，尤其是CD4+细胞。此外，共培养hmmyCAF和T细胞发现与T细胞耗竭相关的基因（PDCD1、LAG3、HAVCR2、TNFRSF9、ENTPD1和CXCL13）显著上调，表明hmmyCAFs可能抑制促免疫原性细胞功能。

hmmyCAFs的存在与HCC较差的临床状态相关

肿瘤微环境中的细胞间通信主要通过直接物理接触发生。使用mistyR包量化hmmyCAFs的主要细胞相互作用者，识别内皮细胞和髓系细胞作为主要接触伙伴。这些细胞类型共同建立了一个空间组织的侵袭前沿生态位，协调多种促肿瘤机制。这些基质细胞通过胶原基因（COL1A1/2、COL4A1/2、COL6A1-3）、纤连蛋白（FN1）和多种层粘连蛋白亚型（LAMA2-5、LAMB1-3、LAMC1/3）的高表达表现出特别强的ECM重塑 involvement。值得注意的是，hmmyCAFs表现出细胞类型特异性整合素异二聚体参与用于微环境串扰。肿瘤细胞相互作用优先涉及α2β1、α3β1和αvβ8整合素组合，而血管区室通信（内皮细胞、循环内皮细胞、平滑肌细胞）利用α9β1、α6β1和α1β1配置。T_NK细胞的免疫调节通过独特的α1β1介导结合发生。这种受体特异性表明hmmyCAFs采用分子适应以履行肿瘤-基质相互作用中上下文依赖的作用。这些配体-受体对的识别突出了两种互补机制：通过膜结合受体的直接细胞间接触，以及通过分泌糖蛋白的基质介导信号。整合素作为协调粘附和信号的异二聚体跨膜受体，似乎对hmmyCAFs介导的细胞迁移和微环境组织调节至关重要。机制上，hmmyCAFs似乎通过双重屏障和信号功能协调肿瘤微环境调节。这些细胞利用F11R/JAM1介导的细胞间连接通过JAM3与癌症和基质细胞相互作用，可能建立限制免疫细胞浸润的物理排斥区。补充这种屏障机制，hmmyCAFs分泌一个特化的基质 repertoire，包含血小板反应蛋白（THBS1/2）和腱生蛋白C（TNC），它们结合CD44受体、α3β1整合素和 syndecan-1（SDC1）以介导与多种细胞群体（包括浆细胞和平滑肌细胞）的串扰。hmmyCAFs的细胞外重塑能力通过它们多功能组织重塑效应物的过表达进一步放大。这种分子 repertoire 包括：1）结构组织者（POSTN、LOXL1）实现基质交联；2）蛋白水解调节剂（FAP、MMP1）促进基质降解；和3）多功能糖蛋白（TNC）桥接机械和信号功能。这种基质修饰酶和结构成分的协调表达将hmmyCAFs定位为肿瘤相关ECM动态的核心架构师。除了ECM调节，hmmyCAFs部署一个多方面的分泌组以通过干性调节和增殖信号增强恶性进展。多效因子SEMA3C维持癌症干细胞群体同时驱动血管生成和侵袭过程。POSTN证明通过整合素αvβ3介导的Akt/PKB生存通路和Wnt/β-catenin级联的双重信号激活维持肿瘤扩张。CXCL6，虽然经典地是免疫调节性的，但矛盾地加速HCC中的肿瘤生长和转移传播。分子武器库扩展到包括：1）通过转录重编程的SNAI2介导的凋亡抵抗；2）常规有丝分裂原驱动因子（TGFB1、EGF、VEGFA）放大增殖信号；和3）通过LSD1介导的干扰素抑制和Wnt5a诱导的免疫抑制生态位形成的免疫颠覆机制。值得注意的是，Wnt5a分泌建立有利于转移传播的免疫抑制生态位。这种干性增强因子、生存信号和免疫调节成分的协调表达揭示了hmmyCAFs作为TME优化的代谢架构师。它们加强基质支持网络同时主动拆除抗肿瘤免疫的双重能力强调了在恶性进化中的核心作用。为了研究hmmyCAFs的促肿瘤能力，对来自癌症基因组图谱（TCGA）的包含365个病例的HCC队列进行生存分析。使用签名面板（ACTA2、POSTN、COL1A1、FAP）进行hmmyCAF活性的基因集变异分析（GSVA）量化，显示升高的hmmyCAF活性与降低的无进展生存期显著相关（HR = 0.66，95% CI = 0.47-0.94，p = 0.0202）。随后，检查了hmmyCAF浸润与已建立的免疫治疗反应预测因子之间的关系：肿瘤突变负荷（TMB）、微卫星不稳定性（MSI）和免疫检查点表达谱（PD-1/PD-L1、CTLA-4、TIM-3）。具有较高TMB、MSI或免疫抑制基因表达水平的患者往往对免疫治疗更敏感。显著地，POSTN表达（一个关键的hmmyCAF标志物）与TMB评分表现出显著的负相关（Spearman's rho = -0.22，p = 2.04e-05），表明hmmyCAF丰度与HCC免疫治疗耐药之间的潜在机制联系。值得注意的是，POSTN表达与关键免疫检查点调节因子（ADORA2A、CD160、CD244）呈负相关，同时与VEGFR2呈正相关，VEGFR2是一种既介导血管生成信号又介导转移相关免疫抑制的双功能介质。为了评估临床意义，应用ImmuCellAI算法对TCGA-HCC患者（N = 365）按预测的免疫治疗反应性进行分层。显著地，POSTN水平在免疫治疗敏感亚组（n = 10）中相比耐药对应组（n = 411，p<0.005）显著减弱。通过测量晚期HCC患者PD-1免疫治疗前后配对血清样本中的POSTN水平，发现治疗前POSTN表达较低，免疫治疗后显著增加。机制上，这些发现表明hmmyCAF衍生的POSTN可能通过两种互补途径协调免疫逃避：1）下调T细胞抑制检查点，和2）VEGF受体介导的血管生成建立免疫抑制血管生态位。升高的POSTN与免疫治疗耐药模式（降低的TMB、减少的检查点表达）的收敛支持其作为免疫检查点阻断（ICB）无反应生物标志物的潜力。从这些多组学证据中出现治疗意义：将血管生成抑制剂与ICB配对的组合策略可能规避hmmyCAF介导的免疫抑制， potentially 恢复基质丰富微环境中HCC患者的抗肿瘤 immunity。

讨论

我们的snRNA-seq以单细胞分辨率描绘了HCC的基质组成，识别成纤维细胞作为HCC基质的核心成分。与LSEC和内皮细胞一起，成纤维细胞构成HCC中的主要基质细胞群体。空间解卷积进一步证明成纤维细胞和髓系细胞在侵袭前沿内的选择性富集，与它们在屏障形成和免疫调节中的作用一致。值得注意的是，LSEC表现出免疫调节基因（CLEC1B、DNASE1L3）的上调，表明它们通过ECM重塑对免疫耐受的贡献。这些发现解决了先前批量组织分析中的关键差距，提供了对TME空间架构的前所未有的洞察。具体地，成纤维细胞在侵袭前沿的选择性富集强调了它们作为肿瘤侵袭关键驱动者的潜在作用（例如，通过突破基底膜和促进组织渗透），同时它们的免疫调节功能——与LSEC（通过ECM重塑介导免疫耐受）合作——共同建立HCC的免疫抑制微环境。这种单细胞水平表征显著推进了我们对HCC TME空间和功能异质性的理解。空间转录组学发现显著的肿瘤内代谢异质性：高代谢区域（富集氧化磷酸化和糖酵解通路）招募细胞毒T_NK细胞（p < 0.001），而低代谢生态位（特征为缺氧和脂质代谢）积累免疫抑制浆细胞和恶性细胞。这种代谢-免疫共分布阐明了区域免疫治疗耐药——缺氧区域同时排斥效应淋巴细胞同时富集免疫抑制群体，创建“免疫沙漠”。这种机制理解突出了靶向代谢检查点（例如，缺氧响应纳米治疗）以克服当前免疫治疗障碍的治疗潜力。这些机制的核心是缺氧代谢肌成纤维细胞（hmmyCAFs），它们作为空间组织免疫抑制生态位的架构师。共表达ACTA2、POSTN、FAP和COL1A1，hmmyCAFs在侵袭前沿富集（Ro/e = 2.7，p<0.001）。它们建立双重屏障：胶原XV依赖性物理排斥（隔离CD8+ T细胞）和POSTN驱动分子抑制（分泌POSTN、SEMA3C、CXCL6以抑制T细胞）。空间相关分析揭示hmmyCAFs还通过整合素信号（与肿瘤细胞的α2β1/αvβ8；与T_NK细胞的α1β1）和POSTN-αvβ3-Akt/Wnt轴的激活驱动T细胞功能障碍，创建Wnt5a富集生态位促进免疫逃避。缺氧介导的代谢重编程和转录因子驱动分化表观遗传地强制执行它们的特化。临床变量进一步调节hmmyCAF功能在免疫治疗耐药中。在晚期HCC（III-IV）中，hmmyCAFs从侵袭前沿空间扩展到肿瘤核心（Ro/e = 2.7 到 4.1，p<0.001），由TGF-β激活驱动。这种增殖增强免疫抑制：胶原XV介导CD8+ T细胞排斥（减少浸润）。纤维化前变化（例如，正弦毛细血管化）与hmmyCAF分泌的胶原XV协同加强物理屏障功能。在肝硬化中，髓系细胞富集进一步通过分泌IL-10和TGF-β驱动免疫抑制，抑制DC抗原呈递。这种组合可能形成“免疫抑制循环”，最终降低ICB反应率。集体地，这些变量调节hmmyCAF空间分布、代谢和分泌，共同塑造TME的免疫抑制能力并决定免疫治疗反应。这种基质-免疫轴的临床意义通过hmmyCAFs活性与不良结果之间的稳健相关性得到强调：升高的POSTN表达预测较差的无进展生存（HR = 0.66，p = 0.02）并通过TMB抑制（Spearman's r = -0.22，p = 2.04e-05）和关键免疫检查点分子（ADORA2A、CD160）的下调驱动免疫治疗耐药，在治疗反应患者中观察到显著较低水平（p<0.005）。因此，POSTN空间密度作为预后和合理治疗分层的双重生物标志物出现，指导抗血管生成剂与免疫检查点阻断的组合以克服微环境介导的耐药，特别是在MASLD驱动HCC发病率上升的背景下。我们进一步评估针对hmmyCAFs和POSTN的新兴治疗策略，利用CAF靶向剂的临床前和早期临床数据。成纤维细胞激活蛋白（FAP），包括hmmyCAFs在内的激活CAFs的关键标志物，调节它们的促肿瘤功能。临床前数据支持FAP抑制作为可行策略。OMTX705，一种小分子FAP抑制剂，在胰腺模型中减少CAF增殖/胶原分泌，通过ECM破坏逆转T细胞排斥，一种与hmmyCAFs相关的机制，hmmyCAFs依赖胶原XV用于物理T细胞屏障。TGF-β通过增强信号（r = 0.41，p = 0.008）驱动hmmyCAF向免疫抑制表型。TGF-β阻断剂（例如，galunisertib）减少TGF-β诱导的POSTN和CAF免疫抑制，下调hmmyCAF POSTN并使T细胞对ICB敏感。Lorvotuzumab（抗TGF-β）通过减少CAF激活、破坏缺氧适应和减轻乳酸介导的T细胞功能障碍增强ICB疗效。组合抗血管生成剂（例如，VEGF抑制剂）可能提高疗效。贝伐珠单抗（抗VEGF）正常化肿瘤血管以增强T细胞浸润；与galunisertib配对，它可能抑制hmmyCAF TGF-β信号，破坏胶原XV屏障和POSTN-检查点相互作用。这些策略（靶向FAP、TGF-β或抗血管生成剂）可能通过解决它们的激活、信号和功能来破坏hmmyCAF介导的免疫治疗耐药。未来研究应在分层HCC队列中验证这些组合以优化选择和转化洞察。本研究建立hmmyCAFs作为HCC免疫逃避的关键调节者，它们的空间组织和双重机制（物理屏障 + 分子抑制）将它们定位为高价值治疗靶点。靶向策略可以在三个层次上优先考虑：1. 阻断POSTN信号轴：hmmyCAFs特异性过表达POSTN，通过αvβ3-Akt/Wnt通路诱导T细胞耗竭。卵巢癌的临床前验证支持这种方法：抗POSTN中和抗体（例如，mAb 10A6）抑制肿瘤生长/转移；2. 利用代谢脆弱性：hmmyCAFs的缺氧代谢特征（GSVA富集缺氧/糖酵解通路）使它们易受LDHA抑制剂影响。这种策略已成功消耗缺氧CAFs并增强肺腺癌中的免疫治疗；3. 开发组合方案：鉴于hmmyCAF丰度与免疫治疗耐药之间的关联（高POSTN与PFS HR = 0.66，p = 0.02相关），将FAP靶向CAF消耗与抗PD-1 therapy组合可以同时破坏物理屏障和分子抑制——镜像胰腺癌模型，其中这种方法使生存加倍。然而，临床转化面临两个关键挑战：1. 靶向特异性：避免损害参与组织修复的非hmmyCAF亚群（例如，静止成纤维细胞）；2. 亚型可塑性：hmmyCAFs可能通过表型切换逃避治疗（例如，FAP下调，代谢重编程）。未来研究必须在免疫活性HCC类器官中验证hmmyCAF特异性标志物，并探索基于空间hmmyCAF密度的患者分层以优化“基质重编程-免疫激活”协同作用。虽然我们的发现提供了对hmmyCAFs在HCC免疫治疗耐药中的新颖洞察，但我们承认局限性。首先，我们的核心单细胞/空间分析使用单个患者的肿瘤（四个区域），捕获肿瘤内异质性但可能低估患者间变异性。为了缓解这一点，我们通过公共队列（TCGA、GEO、GSA-Human）验证了关键发现，显示跨HCC人群一致的POSTN-免疫逃避关联。然而，在更大、多中心队列（不同病因/阶段）中的前瞻性验证对于建立临床相关性仍然关键。未来研究将在独立、注释良好的队列中使用多组学验证发现，以阐明临床-hmmyCAF-免疫治疗关系，实现精确生物标志物和HCC免疫治疗的分层策略。

实验部分

患者和样本

从复旦大学附属肿瘤医院肝胆外科收集1名年龄38-69岁患者的肿瘤组织。新鲜收集的来自不同区域四个位置的样本用于snRNA-seq和stRNA-seq。此外，从同一医院收集11名HCC患者PD-1治疗前后的配对血浆样本，用于ELISA检测POSTN以评估免疫治疗疗效。

伦理声明

本研究经复旦大学上海医学院华山医院伦理咨询委员会批准（KY2020-1228，2020年11月）。获得每位涉及个体的书面知情同意。

细胞系和培养

人LX-2细胞（Cat# GNHu58）和Jurkat细胞（Cat# SCSP-513）购自国家认证细胞培养物收藏中心（中国）。这些细胞系在购买时进行了短串联重复（STR）测试。STR测试结果由供应商和第三方测试机构提供，确保细胞系的真实性。所有细胞系在RPMI-1640（Thermo Fisher Scientific，美国）中培养，补充10%胎牛血清（FBS，HyClone，美国）和1%青霉素/链霉素（Gibco，美国），在37°C、5% CO₂下。

共培养

使用0.4 μm孔径Transwell插入物（Corning，美国）建立非接触transwell共培养系统。1 × 10⁶ LX-2细胞接种在下层室，而0.7–0.9 × 10⁶细胞放置在上层室。研究包括两组：（i）共培养组（TGF-β预处理LX-2细胞与Jurkat细胞共培养）和（ii）对照组（Jurkat细胞单独培养）。对于共培养组，下层室中的LX-2细胞首先用20 μg mL^?1重组TGF-β（Novoprotein，上海，中国）处理24小时。随后，下层室中的条件培养基用新鲜RPMI-1640（Thermo Fisher Scientific，美国）替换，Jurkat细胞接种到上层室以启动共培养。

ELISA测试

使用商业ELISA试剂盒（Yfxbio Biotech，南京，中国）按照制造商说明分析血浆样本（≈10 μL）中的POSTN蛋白水平。使用Infinite F50微孔板阅读器（TECAN，瑞士）测量吸光度。所有剩余血浆样本在-80°C储存以供未来分析。

定量实时PCR

使用RNA-easy Isolation Reagent（Vazyme，南京，中国）从培养细胞中提取总RNA。使用NanoDrop 2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific，美国）评估RNA质量和数量。使用商业试剂盒（TransGen Biotech，北京，中国）按照制造商说明合成互补DNA（cDNA）。使用Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme，南京，中国）在ABI Q5 Real-Time System（Thermo Fisher Scientific，美国）上进行实时定量PCR以量化mRNA水平。基因表达水平归一化到看家基因GAPDH，并使用2^?ΔΔCt方法计算相对定量。所有靶基因的引物序列列在支持信息表S9中。

数据收集

为确保可重复性和全面绘制HCC肿瘤微环境，整合了多个公开可用的单细胞转录组数据集。具体地，GSE149614（n = 21）和GSE156625（n = 78）数据集从Gene Expression Omnibus（GEO）存储库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）获得。CRA002308数据集从人类基因组序列存档（GSA-Human）检索。对于大规模队列验证，处理过的RNA-seq数据和临床病理学元数据从TCGA-LIHC通过TCGA数据门户（https://portal.gdc.cancer.gov/）公开检索。所有数据集经过严格质量控制和归一化以实现跨平台可比性。这种整合方法利用空间、单细胞和批量转录组资源来剖析HCC中的基质-免疫串扰和恶性细胞异质性。

空间转录组实验的组织准备

收集的肿瘤组织用冷PBS冲洗，并用预冷OCT（Sakura，美国）在干冰中包埋10分钟，并在-80°C冰箱中储存。OCT包埋的组织块修剪到适当大小，并在-20°C freezer（Thermo，美国）中切片。从OCT包埋样本切割10 μm厚度的三到四个连续冷冻切片用于H&E染色、stRNA-seq文库制备和IF染色。使用RX50显微镜扫描仪（Sunny Optical，中国）获得H&E样本的明场图像用于组织病理学评估。

单核RNA测序

stRNA-seq的剩余组织用于snRNA-seq。核分离和透化在Chromium Next GEM Single-Cell Multiome ATAC + Gene Expression用户指南（CG000338）的指导下进行。使用Chrom