二甲双胍通过调控JNK通路抑制PANoptosis机制减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤的研究

本综述系统阐述二甲双胍（Met）通过抑制c-Jun N末端激酶（JNK）磷酸化、降低活性氧（ROS）生成，进而调控PANoptosis（凋亡-焦亡-坏死性凋亡复合程序性细胞死亡）机制，显著减轻心肌缺血再灌注损伤（MIRI）的创新机制。研究揭示Met通过多靶点干预细胞死亡通路，为心血管保护提供了全新治疗策略。

　　

引言：心肌缺血再灌注损伤的细胞死亡新机制

冠状动脉疾病是全球主要心血管疾病，急性心肌梗死最有效的治疗方法是再灌注治疗，但再灌注过程本身会导致心肌缺血再灌注损伤。其机制涉及钙超载、氧化应激、线粒体功能障碍和炎症介导的心肌细胞死亡。PANoptosis作为2019年命名的炎症性程序性死亡通路，整合了凋亡、焦亡和坏死性凋亡的关键特征，在多种疾病发展中起重要作用。二甲双胍作为广泛使用的抗糖尿病药物，近期被发现具有显著心血管保护作用，本研究旨在探究其通过JNK通路调控PANoptosis机制在心肌缺血再灌注损伤中的保护作用。

材料与方法：多维度评估心肌损伤机制

研究使用Sprague-Dawley大鼠建立心肌缺血再灌注损伤模型，通过左前降支冠状动脉结扎30分钟后再灌注24小时模拟临床病理过程。实验设置假手术组、MIRI模型组、不同剂量二甲双胍治疗组（50、100、200 mg/kg）、JNK激动剂ANI干预组和JNK抑制剂SP600125组。

采用氯化三苯基四氮唑（TTC）染色测定心肌梗死面积，麦胚凝集素（WGA）染色评估心肌细胞肥大情况。通过酶联免疫吸附测定（ELISA）检测血清心肌损伤标志物心肌肌钙蛋白I（c-TnI）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脱氢酶（LDH）以及炎症因子白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平。使用活性氧检测试剂盒测定细胞内ROS含量。

Western blot分析检测PANoptosis相关蛋白表达：受体相互作用蛋白激酶（RIPK1）、磷酸化RIPK1（p-RIPK1）、RIPK3、p-RIPK3、混合谱系激酶结构域样蛋白（MLKL）、p-MLKL、caspase-1、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、gasdermin D、Bcl-2关联X蛋白（Bax）、B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、caspase-3、ZDNA结合蛋白1（ZBP1）、黑色素瘤缺乏因子2（AIM2）以及JNK、p-JNK、AMP活化蛋白激酶（AMPK）、p-AMPK、核因子κB（NF-κB）p65、p-NF-κB p65等信号通路蛋白。

免疫荧光染色检测TdT介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）、gasdermin D、p-RIPK3和p-MLKL表达，流式细胞术分析annexin V/7-AAD和caspase-1染色评估细胞死亡类型。

结果：二甲双胍显著减轻心肌损伤并抑制PANoptosis

心肌功能改善与损伤标志物变化

TTC染色显示MIRI组出现明显心肌梗死区域，二甲双胍治疗组特别是中剂量组（100 mg/kg）梗死面积显著减小。WGA染色显示MIRI组心肌细胞结构破坏和细胞间隙增大，二甲双胍治疗组心肌细胞结构保存完好。ELISA检测显示MIRI组c-TnI、CK-MB、LDH、IL-6、TNF-α显著升高，二甲双胍治疗组这些指标明显降低，中剂量组效果最优。

信号通路调控机制

Western blot分析显示MIRI组AMPK活化被抑制，而二甲双胍作为AMPK激动剂显著激活AMPKα Thr172位点磷酸化。MIRI组NF-κB活化升高，二甲双胍同时抑制缺血再灌注诱导的NF-κB活化。重要的是，JNK在缺血再灌注期间显著激活，二甲双胍治疗降低JNK磷酸化水平。细胞内ROS检测表明MIRI组ROS水平显著高于假手术组，二甲双胍治疗显著降低ROS产生，中剂量组效果最明显。

JNK通路在心肌PANoptosis中的关键作用

JNK激动剂ANI部分逆转二甲双胍的心肌保护作用。TTC染色显示MIRI+Met+ANI组梗死面积较MIRI+Met组增加。WGA染色和心肌损伤标志物检测均显示ANI部分逆转二甲双胍的治疗效果。Western blot显示MIRI组p-JNK/JNK比值显著升高，二甲双胍治疗显著降低该比值，而ANI处理使p-JNK/JNK比值回升。

二甲双胍抑制心肌PANoptosis的分子机制

Western blot分析PANoptosis相关蛋白表达显示，MIRI组细胞死亡相关蛋白表达显著升高，包括cleaved-caspase-1、gasdermin D-N末端、ASC、NLRP3、cleaved-caspase-3、Bax、p-RIP、p-RIPK3、p-MLKL、ZBP1和AIM2。二甲双胍显著抑制这些PANoptosis蛋白表达，抗凋亡蛋白Bcl-2表达增加。ANI部分逆转二甲双胍的保护作用，使PANoptosis蛋白表达部分回升。

流式细胞术分析显示MIRI组PANoptosis率显著增加，二甲双胍治疗显著降低PANoptosis率，ANI处理使PANoptosis率回升。免疫荧光染色显示MIRI组TUNEL、gasdermin D和p-MLKL/p-RIPK3荧光信号显著增强，二甲双胍治疗显著减弱这些信号，ANI部分逆转这种保护作用。

免疫荧光染色检测caspase-8/p-RIPK3和ASC共定位显示MIRI组共定位显著升高，二甲双胍治疗组共定位减少，ANI处理组共定位显著高于Met组但低于MIRI组。

JNK特异性抑制剂SP600125单独使用与二甲双胍具有相似的治疗效果，均能减轻心肌细胞广泛凋亡，进一步证实二甲双胍通过抑制JNK磷酸化减轻心肌细胞PANoptosis。

讨论：多通路协同的心脏保护新视角

心肌缺血再灌注损伤的特征是冠状动脉血流恢复后发生的心肌损伤，导致心肌细胞死亡和梗死面积增加。二甲双胍通过激活AMPK调控下游NF-κB和JNK信号通路，通过调节能量代谢、减轻氧化应激、缓解炎症反应、调节自噬和抑制凋亡来减轻缺血再灌注损伤。

本研究首次证实二甲双胍通过抑制JNK磷酸化减少心肌细胞PANoptosis来减轻MIRI。JNK激动剂ANI部分逆转二甲双胍的治疗效果，表明二甲双胍可能通过多通路发挥作用。研究发现抑制PANoptosis可能为减轻MIRI的破坏性效应提供新方法，靶向抑制PANoptosis关键组分可能减少细胞死亡和炎症，从而改善MIRI结局。

研究还探讨了PANoptosis抑制剂作为二甲双胍替代方案的可行性，以及二甲双胍与PANoptosis抑制剂联合治疗的潜在价值。这种联合方法可能是未来研究的有前景方向，可能带来更有效的MIRI治疗方法。

结论：JNK-PANoptosis轴的心脏保护新机制

本研究证明二甲双胍通过调节JNK信号通路和抑制PANoptosis机制显著减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤。具体而言，二甲双胍降低心肌损伤标志物、炎症细胞因子和ROS的分泌水平，同时减少心肌细胞PANoptosis的发生。JNK激动剂ANI部分逆转二甲双胍的治疗效果，验证了JNK通路在二甲双胍心脏保护作用中的关键角色。这些发现为二甲双胍减轻MIRI的潜在机制提供了新见解，并提出了治疗MIRI的潜在治疗策略。