GalNAc偶联siRNA中硫代磷酸酯非对映异构体分离新策略：色谱与离子迁移谱技术的比较研究

《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》：Separation of PS diastereomers in GalNAc-conjugated siRNA—a comparative study of chromatographic and ion mobility mass spectrometry approaches

本刊推荐：针对GalNAc偶联siRNA中磷硫酰化(PS)非对映异构体分离难题，研究人员系统比较了离子对反相色谱(IP-RP)、阴离子交换色谱(AEX)、亲水相互作用色谱(HILIC)与离子迁移质谱(IMS)四种技术。研究发现AEX在色谱法中分离度最优，而基于碎片化的IMS策略可实现反义链全部16种非对映异构体的气相分离。该研究首次证实IMS定量结果与LC-UV数据高度吻合，为寡核苷酸药物质量控制提供了新的技术路径。

　　

在生物医药领域迅猛发展的今天，寡核苷酸药物正成为攻克"不可成药"靶点的新希望。其中小干扰RNA(siRNA)作为明星分子，已有多款药物获批上市。然而这些分子在化学修饰过程中会引入磷硫酰化(phosphorothioate, PS)修饰，该过程会在磷原子上形成新的手性中心，产生大量非对映异构体(diastereomer)。以含4个PS位点的反义链为例，理论上存在2⁴=16种异构体，而感官链因含有6个PS位点，异构体数量更高达64种。这些异构体的比例分布会显著影响药物的药代动力学特性，因此监管机构对批次间一致性控制提出了严格要求。

传统色谱方法如离子对反相色谱(IP-RP)、阴离子交换色谱(AEX)和亲水相互作用色谱(HILIC)虽常用于寡核苷酸分析，但通常需要抑制非对映异构体分离以保持峰形。如何实现高分辨率分离成为行业痛点。与此同时，离子迁移质谱(ion mobility mass spectrometry, IMS)作为新兴技术，在异构体分离方面展现出独特优势，但其定量可靠性尚未得到充分验证。

为解决这一技术瓶颈，由Mona-Katharina Bill领衔的研究团队在《Analytical and Bioanalytical Chemistry》上发表了最新成果。研究人员设计了两类GalNAc偶联siRNA模型化合物：siRNA#1和siRNA#2，其反义链含有4个PS连接，感官链含有6个PS连接。通过系统优化三种色谱方法，并创新性地采用碎片化IMS策略，首次实现了对复杂siRNA样品中非对映异构体的全面表征。

关键技术方法包括：采用离子对反相色谱(IP-RP)、阴离子交换色谱(AEX)和亲水相互作用色谱(HILIC)三种液相色谱方法进行分离优化；利用循环离子迁移质谱(cyclic IMS)系统进行气相分离；通过碰撞诱导解离(CID)产生终端片段（b₅^2-和w₅^3-）以降低分析复杂度；通过LC-UV与IMS数据的相关性分析验证定量可靠性。

Diastereomer analysis of siRNA single strands via LC

研究人员首先使用简化模型（仅含单个PS连接）评估色谱方法的选择性。如图1b所示，AEX在三个简化模型中实现了基线分离（分辨率R=0.9-6.3），IP-RP在三个模型中表现良好（R=2.4-3.2），而HILIC仅能分离两个模型（R=1.3-1.7）。值得注意的是，PS连接的位置显著影响分离效果，例如PS-4模型在HILIC中可分离，而在AEX和IP-RP中则不能，表明分离效果具有序列依赖性。

对完整siRNA链的分析进一步证实了AEX的优越性（图2）。对于含4个PS的反义链，AEX可分辨12个峰，IP-RP显示6个宽峰，而HILIC仅显示4个未完全分离的峰。对于更复杂的感官链（含6个PS），AEX可分辨8个峰，而IP-RP和HILIC均呈现单峰宽化现象。研究人员推测HILIC的分离效果与寡核苷链的高级结构相关，而UV熔解曲线显示单链缺乏典型折叠结构，这解释了HILIC在复杂样品中分离度不足的原因。

IMS as alternative for siRNA diastereomer analysis

面对色谱法的局限性，研究人员转向离子迁移质谱技术。如图3a所示，完整单链的IMS分析未显示非对映异构体分离，仅出现峰宽化现象。这与此前报道一致：大分子中构象差异过小导致分离困难。

借鉴Sharon等人的策略，研究团队采用碎片化方法：通过CID产生终端五聚体片段，将分析复杂度从16种异构体降至4种。如图3b所示，b₅^2-和w₅^3-片段的迁移谱均显示四个清晰峰，对应RR、RS、SR、SS四种构型。值得注意的是，反义链3'端和5'端的峰强度分布截然不同（b₅^2-：峰1>峰2≈峰3>峰4；w₅^3-：峰3>峰2≈峰4≈峰1），证实非对映异构体比例具有位置特异性。

Quantitative assessment of diastereomers via IMS

为验证IMS的定量能力，研究人员合成了仅含两个PS连接的简化模型（siRNA#1 PS-1+2和PS-3+4）。如图5所示，三种方法均显示出互补的分离特性：AEX对PS-1+2实现基线分离，而IP-RP对PS-3+4分离更优。IMS则对所有样品均实现完全分离。

将峰面积按强度排序后比较（表1），发现IMS与色谱数据高度一致：3'端PS差异<2%，5'端<3%。这种定量相关性证实IMS不仅能定性区分非对映异构体，还能提供可靠的定量信息。

结论与展望

本研究系统评估了多种分析技术对siRNA非对映异构体的分离能力。结果表明，在色谱法中AEX表现最优，适合作为质控常规方法；而IMS凭借其卓越的分离度和定量可靠性，成为极具潜力的补充技术。特别值得关注的是，碎片化IMS策略不仅能解决色谱法难以分离的复杂样品，还可通过多级IMS-IMS分析进一步解析单个PS连接的构型信息。

这项工作为寡核苷酸药物开发提供了重要技术支撑：IMS可作为早期药物发现阶段快速评估异构体组成的工具，避免针对每个新序列优化色谱方法的繁琐流程。未来通过结合立体纯参照品和理论碰撞截面计算，IMS有望成为监管机构认可的标准化分析方法，推动寡核苷酸药物治疗领域的规范化发展。