利用长读长RNA测序技术解析欧洲家貂呼吸道干扰素应答及流感病毒感染转录组特征

本研究采用Oxford Nanopore长读长测序技术，首次系统描绘了欧洲家貂（Mustela putorius furo）呼吸道细胞在干扰素（IFN-α）刺激和甲型流感病毒（IAV）感染下的全转录组响应特征。研究发现多个与人类同源的干扰素刺激基因（ISGs）在貂体内显著上调，鉴定出新型ISG转录本，并揭示poly(A)尾 elongation与核糖体通路抗病毒应答的关联性，为利用貂模型研究流感病毒宿主适应机制提供了重要分子资源。

　　

引言：貂模型在流感研究中的价值与挑战

欧洲家貂（Mustela putorius furo）被公认为研究人类和禽流感病毒感染的黄金标准小动物模型。其肺部结构与人类相似，气道内特定唾液酸受体分布与人类高度一致，且能直接感染多种人源甲型流感病毒而无需宿主适应。与小鼠相比，貂类不仅出现打喷嚏、发热、嗜睡等典型感染症状，还能通过直接接触或气溶胶传播病毒，是研究IAV感染临床结局和传播机制的理想模型。

然而，尽管貂模型在流感病原学和免疫学研究中有广泛应用，其免疫应答表征工具仍十分有限。特别是对I型和III型干扰素（IFNs）分泌及干扰素刺激基因（ISGs）上调等先天免疫应答的研究多依赖qPCR技术。貂基因组在NCBI数据库中的注释极不完善，多数ISGorthologs仅通过计算预测，严重制约了对其抗病毒机制的理解。第三代测序技术（如Oxford Nanopore）的出现为解析全长转录本、识别可变剪接事件和精确测定poly(A)尾长度提供了革命性手段。

研究设计与测序特征

本研究分别从体外和体内两个层面构建实验体系：体外采用貂肺上皮细胞系（FRL）经重组貂IFN-α处理24小时；体内则通过鼻内感染IAV毒株A/Perth/269/2009（H1N1pdm09），在感染后6小时和24小时采集鼻甲组织。采用ONT PCR-cDNA条形码试剂盒进行测序，共获得约4630万条通过过滤的读长，N50读长为743 nt，质量中位值为12.6。

通过Bambu和SQANTI3分析流程，研究团队鉴定出大量新型转录本：其中已知转录本（NM）仅64条，而预测转录本（XM）达57,475条，新发现转录本1,414条和新基因1,120个。94.36%的异构体属于全剪接匹配（FSM）类型，4.82%为基因间区类型，表明大多数转录本与参考转录本剪接位点匹配，部分新型基因位于基因间隔区。

貂类ISG orthologs的鉴定与调控特征

差异表达分析显示，IFN-α处理的FRL细胞中存在1,120个显著差异表达基因（DEGs）。体内实验中，IAV感染6小时仅发现20个DEGs，而24小时则鉴定到1,131个DEGs，表明先天免疫通路激活需要更长时间。

研究人员重点验证了6个与人类抗IAV活性ISG同源的貂类基因：Tetherin、ISG15、MOV10、Viperin、TRIM22和OAS2。除MOV10外，其余基因在IFN处理后均显著上调（p<0.01），其中Tetherin、ISG15、Viperin和TRIM22上调幅度达300-500倍，OAS2中度上调约8倍。此前研究中通过菌落PCR验证的貂Mx1主要转录本（XM_004762192.2）在本研究的纳米孔测序数据中得到确认，且在IAV感染貂鼻甲组织中强烈上调。

跨物种蛋白序列比对显示，除OAS2外，所有貂ISG与欧洲貂（Mustela luterola）相似度最高。MOV10和Viperin在不同物种间保守性最高（>80%），而Tetherin分化程度最大。值得注意的是，貂ISG与人类相似度普遍高于小鼠。关键功能域分析揭示：ISG15和MOV10的所有重要功能位点在人与貂间完全保守；而Tetherin（NFκβ激活区）、OAS2（酶活性位点）、Viperin（亮氨酸拉链 motif）和TRIM22（核定位信号）存在物种特异性差异，这些差异可能影响蛋白的亚细胞定位、酶活性和蛋白互作特性。

新型ISG与IST的发现与验证

通过聚焦IFN-α刺激后上调的新型基因（BambuGene）和转录本（BambuTx），研究团队按表达水平（低、中、高）筛选出GCA、LIPA和LOC106005667基因的新型IST。这些转录本呈现外显子跳跃和5′端变异特征。RT-qPCR验证显示大多数新型ISG/IST在IFN处理组有上调趋势（虽未达显著水平）。特别值得注意的是，BambuGene8284在mock和IFN处理组均呈现极高表达水平，且在IAV感染貂鼻甲组织中表达量随感染时间（6→24 hpi）显著增加。

IFITM基因家族中的新型跨剪接转录本

IFITM基因家族编码的蛋白通过限制病毒复制周期早期阶段介导抗病毒活性。研究发现一个标注为貂IFITM3的NCBI序列（XM_045067236.1）在IFN处理的FRL细胞中高度上调，因其与人类IFITM2/3均具有高度序列相似性，被重新命名为IFITMx。

IGV可视化分析发现映射到不同预测IFITM转录本外显子的读长，提示存在跨剪接事件。研究人员鉴定出三种新型转录本（Transcript 1-3），其预测蛋白均包含调控囊泡膜融合的关键CD225结构域，主要差异位于N端区域。通过设计特异性引物进行RT-qPCR验证，发现仅Transcript 1在体内外均有表达证据，且在体内表达更为明显，但不受IFN处理或IAV感染的显著调控。

poly(A)尾调控与病毒感染通路的关联

纳米孔测序技术首次实现对貂转录组poly(A)尾长度的全转录组评估。所有数据集显示线粒体基因median poly(A)长度约52 nt，核基因约68 nt，与人类多聚腺苷化组研究一致。IAV感染24小时样本中poly(A)尾长度>400 nt的读长比例最高，提示感染与poly(A)尾延长存在相关性。

KEGG通路富集分析发现，mock对照组中蛋白酶体通路poly(A)尾长度较短，而代谢相关通路较长。差异多聚腺苷化分析显示，IFN处理的FRL细胞中，核糖体、COVID-19和氧化磷酸化通路相关基因的poly(A)尾发生显著延长，表明poly(A)尾延长与宿主抗病毒应答存在潜在联系。这一发现与人类细胞系中SARS-CoV-2感染研究结果高度一致。

讨论与展望

本研究通过长读长测序技术极大丰富了貂转录组注释，发现1,400余个新型转录本，证实了第三代测序技术在 incomplete 转录组研究中的强大优势。研究不仅鉴定了貂类ISG orthologs的主要转录变体，还揭示了物种间关键功能位点的差异，为后续功能研究提供了分子基础。

发现的跨剪接IFITM转录本虽表达量较低，但可能作为备份转录本增加IFITM家族多样性以应对IAV感染。poly(A)尾分析结果与人类多聚腺苷化组的高度相似性，进一步支持貂作为人类感染模型的有效性。

研究的局限性包括鼻甲样本RNA完整性较低、PCR扩增引入的定量偏差等。未来研究可通过单细胞测序解析细胞类型特异性转录调控，结合蛋白质组学验证ISG蛋白表达与功能，并将当前发现延伸至貂类疫苗和抗病毒药物评价体系中。

该研究为理解貂类先天免疫应答提供了全面转录组资源，对促进貂模型在流感病毒宿主适应机制研究和抗病毒策略开发中的应用具有重要价值。