基于双发射胞嘧啶类似物的pH诱导i-基序折叠的比率检测

《ChemBioChem》：Ratiometric Detection of pH-Induced i-Motif Folding Based on a Dual Emissive Cytosine Analog

双发射荧光探针TCC基于2-噻吩基-3-羟基香豆素结构，用于比率检测DNA i-动机结构折叠中的水合度、碱基堆积及质子化状态变化，可区分匹配/非匹配碱基对及缺失位点，为实时监测DNA结构动态提供工具。

　　本研究开发并表征了一种双发射的胞嘧啶类似物（TCC），其基于3-羟基香豆素（3HC）结构。这种荧光探针被整合到寡脱氧核苷酸（ODN）中，以监测DNA i-发夹结构的折叠状态。TCC展现出两个不同的发射带（IN*和IT*），每个发射带对微环境的变化有不同的响应，从而实现了比率型检测。通过系统地研究TCC在不同溶剂和DNA结构中的光物理特性，包括单链、双链以及i-发夹形成序列，我们发现IN*/IT*发射比和IT*发射波长可以作为衡量水合程度、碱基堆积以及质子化状态的可靠且相互独立的指标。在完全配对的双链结构中，T*发射带被淬灭且发生蓝移，而i-发夹的形成则导致荧光增强和T*发射波长的红移。此外，该探针还能够区分错配碱基对和无碱基位点，进一步揭示了局部结构缺陷的信息。总体而言，这种比率型核苷类似物能够实现对i-发夹折叠的实时、多参数监测，并具有高灵敏度，为扩展到其他非规范DNA结构提供了潜力。本研究进一步确立了3-羟基香豆素平台作为设计荧光传感器以监测动态核酸结构的强大工具。

i-发夹结构是一种非规范的DNA四链体，其稳定性依赖于在弱酸性条件下形成的半质子化的C·C?碱基对。这种结构在生物系统中可能具有重要的调控功能，因此对其折叠状态的监测对于揭示其生物学意义至关重要。传统的荧光共振能量转移（FRET）方法虽然可以动态追踪结构变化，但需要双标记，并且对荧光团之间的距离敏感，限制了其应用范围。相比之下，基于单一荧光团的比率型探针能够通过发射比而非绝对强度进行监测，从而提供更简单的检测方式并减少对仪器条件的依赖。此外，波长变化型探针也可以用于比率测量，但这种可能性尚未在DMAC（一种香豆素衍生物）中被探索。本研究提出了一种新的方法，将单探针整合进DNA结构中，而不破坏其整体构型，从而实现了对i-发夹折叠的非干扰性检测。

TCC的光物理特性在不同溶剂中被系统研究，以评估其对环境变化的响应能力。通过选择多种极性不同的溶剂，包括亲水性溶剂（如HFIP、H?O、MeOH、EtOH、BuOH）和非极性溶剂（如乙腈、1,2-二氯乙烷、氯仿、乙酸乙酯、四氢呋喃和二氧六环），我们发现TCC和FCC的吸收和发射特性受到溶剂极性和氢键供体能力的显著影响。TCC和FCC在所有溶剂中均表现出双发射特性，其中IN*和IT*分别对应高能和低能发射带。这种双发射特性使得它们能够通过发射比和波长变化来区分不同的微环境。在极性较高的溶剂中，发射比显著增加，表明TCC对水合环境的变化具有较高的灵敏度。值得注意的是，尽管这些溶剂的介电常数相近，但TCC和FCC的发射比变化主要由氢键相互作用引起，而非极性变化。这种特性使得TCC成为一种理想的探针，用于监测DNA结构中的水合变化。

进一步的研究表明，TCC在水合环境中的响应能力不仅限于溶剂极性，还与DNA序列的结构有关。通过将TCC整合到单链、双链和i-发夹结构中，我们发现其发射比和发射波长能够有效反映DNA的构型变化。在完全配对的双链结构中，TCC的发射比最高，同时发射波长发生显著蓝移，这表明其处于高度水合的主沟槽中。而在i-发夹结构中，发射比和波长的变化与双链结构形成对比，显示出更强的荧光和更长的发射波长，这与i-发夹结构中碱基堆积和水合程度的变化相关。此外，TCC在不同序列环境下的表现也表明其对局部结构的敏感性，能够区分错配碱基对和无碱基位点。这种能力为研究DNA的结构缺陷和非规范碱基配对提供了新的工具。

为了进一步验证TCC在DNA结构中的适用性，我们研究了其在不同pH条件下的光物理行为。通过紫外光谱和荧光光谱分析，我们发现TCC在pH 5.3至7.2的范围内保持稳定，其发射比和发射波长的变化与i-发夹结构的形成密切相关。CD光谱分析进一步确认了TCC在i-发夹结构中的定位，并揭示了其在不同pH条件下的构型变化。结果表明，TCC能够在pH 5.3时检测到i-发夹的形成，并在pH 7.2时检测到其解折叠，这一过程具有可逆性。这表明TCC不仅能够监测i-发夹的折叠状态，还能在动态环境中提供可靠的信息。

此外，TCC在不同序列背景下的表现也显示出其在DNA结构监测中的独特优势。例如，在包含错配碱基对或无碱基位点的DNA序列中，TCC的发射比和波长变化与配对情况密切相关。这种变化不仅反映了局部水合程度的变化，还揭示了碱基配对对荧光探针的影响。通过将TCC引入特定的序列位置，我们能够实现对DNA构型变化的精确检测，从而为研究DNA的动态行为提供了新的视角。

本研究的结果表明，TCC作为一种双发射的核苷类似物，能够通过其发射比和波长变化实现对DNA结构的非干扰性监测。这种探针不仅能够区分不同的DNA构型，还能在复杂生物环境中提供可靠的信号。其应用潜力不仅限于i-发夹结构的监测，还可以扩展到其他非规范DNA结构的检测。通过进一步的研究，我们可以探索TCC在不同序列和环境下的行为，从而完善其作为荧光探针的应用范围。本研究为设计更高效的荧光传感器提供了理论基础和技术支持，同时也为理解DNA的动态行为和调控机制提供了新的工具。