通过由阳离子[4]螺旋烯-角鲨烯酯自组装而成的两亲性纳米载体实现siRNA的线粒体靶向递送

《ChemBioChem》：Mitochondria-Targeted Delivery of siRNA by Amphiphilic Nanovectors Self-Assembled from a Cationic [4]Helicene-Squalene Ester

线粒体靶向递送、siRNA纳米组装体、细胞色素c氧化酶亚基1、基因沉默、脂质体递送系统、靶向递送效率、mitochondria-specific delivery、siRNA complexation、chiral helicene分子、细胞毒性降低

　　在当前的生物医学研究中，精准地将治疗性核酸递送到细胞的特定亚细胞结构中仍然是一个具有挑战性的课题。为了应对这一问题，科学家们探索了多种策略，旨在提高核酸药物的靶向性与生物利用度。本文中，研究人员开发了一种小型共轭分子，它结合了阳离子的[4]螺旋烯基团和疏脂性的角鲨烯尾部，这种结构使其具备两亲性特征，从而能够有效地与小干扰RNA（siRNA）结合，形成纳米级的组装体，并将siRNA精准地递送到线粒体中。这一发现为线粒体靶向基因治疗提供了新的思路，尤其是在癌症治疗领域，因为线粒体在细胞代谢、信号传导、免疫反应和细胞凋亡等关键过程中扮演着重要角色。

线粒体通常被视为细胞的能量工厂，近年来，它们作为药理学靶点引起了广泛关注。线粒体不仅在维持细胞稳态中发挥核心作用，还与多种疾病的发生和发展密切相关。尤其是在肿瘤治疗中，线粒体的代谢可塑性和功能异常被认为是肿瘤发生和对治疗反应的重要因素。因此，开发能够将核酸药物精准递送到线粒体的工具，对于提高治疗效果、减少副作用以及实现更精准的基因调控具有重要意义。已有研究表明，siRNA可以进入线粒体基质并特异性沉默其编码的mRNA，从而降低线粒体编码的蛋白表达。然而，由于线粒体内部环境复杂，且缺乏高效的递送系统，这一过程仍然面临诸多挑战。

为了克服这些障碍，研究人员设计了一种新型的两亲性分子，其核心是阳离子的[4]螺旋烯结构，辅以疏脂性的角鲨烯链。这种分子在水性环境中能够自组装形成稳定的纳米颗粒，直径大约在100–130纳米之间，并且其荧光特性可以在红光激发下被激活。这一特性使其不仅具有递送功能，还可以作为成像探针，为研究核酸药物的递送路径和靶向性提供了便利。此外，这种纳米颗粒在多种癌细胞系中表现出快速的细胞内化能力，并且在细胞内的分布具有显著的线粒体富集特征，这为进一步研究其在细胞内的行为奠定了基础。

在实际应用中，这种纳米颗粒的靶向性与递送效率是评估其治疗潜力的关键指标。研究人员通过多种实验手段验证了这一纳米系统的性能。首先，通过琼脂糖凝胶电泳迁移率实验，他们评估了该分子与siRNA的结合能力。结果显示，当N/P比（正电荷与负电荷的比值）达到4时，Rac-1（该分子的外消旋体）能够完全结合siRNA，而其两种对映体M-1和P-1则表现出不同的结合效率。其中，M-1在较低的N/P比下表现出更强的结合能力，这可能与其分子结构中的手性特征有关。这一结果与之前的研究一致，表明阳离子螺旋烯衍生物在与核酸结合时，其手性可能影响结合的特异性与效率。

进一步的动态光散射（DLS）和ζ电位分析显示，随着N/P比的增加，纳米颗粒的尺寸逐渐减小，而ζ电位则呈上升趋势。这表明，随着siRNA的结合，纳米颗粒的结构变得更加紧密，且表面电荷增加，有助于其在细胞内的稳定性和靶向性。在N/P比为5时，纳米颗粒的平均直径约为178.6纳米，而当N/P比提高到20时，直径减小至109纳米，ζ电位则达到32.4毫伏。这一结果表明，该纳米系统能够通过调整N/P比来优化其物理化学特性，从而提高递送效率和靶向性。

在细胞毒性研究中，研究人员使用MTT法评估了Rac-1、M-1和P-1对HCT 116细胞的影响。实验结果显示，随着N/P比的增加，细胞毒性也相应提高，但即便在较高浓度下，细胞存活率仍保持在70%以上。这表明，该纳米系统在递送siRNA的同时，其毒性相对较低，这为后续的治疗应用提供了良好的安全基础。此外，不同对映体在细胞毒性方面表现出轻微的差异，其中M-1的毒性略高于P-1，但整体上仍然处于可控范围内。

为了验证该纳米系统的siRNA递送能力，研究人员选择了表达荧光素酶的HCT 116-Luc细胞系，使用siLuc作为模型siRNA。通过调整N/P比和siRNA浓度，他们发现Rac-1能够有效将siLuc递送到细胞内，并显著降低荧光素酶的表达水平。在N/P比为5时，siLuc的浓度为30纳米摩尔，Rac-1的浓度为6.3微摩尔，此时荧光素酶的表达水平下降了约50%。这一结果表明，Rac-1不仅能够有效地结合siRNA，还能将其稳定地递送到目标细胞，并实现有效的基因沉默。值得注意的是，Rac-1的递送效率显著高于传统的脂质体转染试剂Lipofectamine，这进一步突显了其在siRNA递送方面的优势。

在细胞摄取和亚细胞定位研究中，研究人员利用超分辨率共聚焦显微镜和流式细胞术分析了Rac-1与siRNA的共定位情况。实验结果表明，Rac-1能够快速被HCT 116细胞摄取，并且在细胞内的分布主要集中在线粒体区域。使用MitoTracker染料对线粒体进行标记后，观察到Rac-1与线粒体的共定位率达到98%，而与siATTO 488（一种标记了siRNA的荧光探针）的共定位率也达到了48%。这表明，Rac-1能够有效地将siRNA运输到线粒体内部，并且其与siRNA的结合具有较高的稳定性。此外，通过流式细胞术分析，研究人员还发现，Rac-1与siATTO 488形成的复合物在细胞内的分布模式与线粒体染料高度一致，进一步支持了其靶向线粒体的能力。

为了验证Rac-1在实际基因治疗中的应用潜力，研究人员进一步测试了其对线粒体编码的细胞色素c氧化酶亚基1（MTCO1）的沉默效果。通过Western blot分析，他们发现当使用Rac-1–siMTCO1复合物时，MTCO1的表达水平显著下降，仅达到对照组的48%。相比之下，单独使用siMTCO1或Lipofectamine作为转染试剂时，MTCO1的表达水平没有明显变化。这一结果表明，Rac-1不仅能够将siRNA递送到线粒体，还能实现对其编码基因的有效沉默。由于MTCO1在细胞呼吸链中起着关键作用，且其表达水平与多种癌症的发生发展密切相关，这一发现为开发针对线粒体的基因治疗策略提供了有力的支持。

本文的研究结果表明，Rac-1作为一种小型分子，能够在与siRNA结合后形成稳定的纳米颗粒，并将其高效地递送到线粒体中，从而实现对线粒体基因的精准调控。与传统的转染试剂相比，Rac-1表现出更强的线粒体靶向性，这可能与其独特的分子结构有关。此外，该纳米系统的低毒性特性使其在实际应用中更具优势。然而，尽管Rac-1在沉默线粒体蛋白方面表现出色，但其在细胞质中的沉默效率仍略逊于Lipofectamine。这一差异可能与Rac-1的靶向性有关，因为其主要作用是在线粒体内进行RNA沉默，而不是在细胞质中。

综上所述，本文的研究为线粒体靶向siRNA递送提供了一种新的策略。Rac-1的两亲性结构使其能够在水性环境中自组装形成纳米颗粒，同时具备良好的荧光特性，便于成像和追踪。其高效的线粒体靶向性不仅提高了siRNA的递送效率，还减少了对其他细胞成分的非特异性影响。这一发现为开发针对线粒体的新型基因治疗工具提供了重要的理论依据和实验支持。未来，随着对Rac-1及其类似分子的进一步研究，有望将其应用于更广泛的疾病治疗领域，特别是在癌症治疗中，通过调控线粒体功能来抑制肿瘤生长或促进细胞凋亡。此外，该纳米系统的低毒性特征也为其在临床转化中的应用提供了良好的前景。