综述：体外天然产物生物合成的反应工程：挑战与策略

《ChemBioChem》：Reaction Engineering of In Vitro Natural Product Biosynthesis: Challenges and Strategies

体外酶促级联合成自然产物面临转化率低、产物少的问题，通过反应工程（如固定化酶、溶剂优化、中间产物提取）和计算模拟（分子动力学、同源建模）提升效率，但仍需结合实验数据完善模型。

　　自然产物在制药、农业化学、食品和化妆品等领域具有广泛的应用。它们的生物合成通常涉及一系列由酶控制的反应，这些反应在特定的液体环境中进行。在体外条件下重建这些多步骤的反应过程，具有显著的技术应用潜力。然而，多个酶在同一反应器中协同工作时，往往面临诸多挑战。本文旨在总结体外酶级联反应在实现高底物转化率和产物产率方面的困难，并探讨已有的和新兴的改进策略。

在自然界的生物合成过程中，酶驱动的反应级联是合成复杂分子的重要机制。这些反应通常发生在细胞内，通过一系列相互关联的代谢途径实现，每个步骤的产物成为下一步反应的底物。这种生物催化系统的一个显著特征是高度的化学、区域和立体选择性，与传统的化学催化方法相比，这使得酶在反应过程中能够有效减少副产物的生成，并避免反应中间体的稳定性或毒性问题。然而，当这些反应被移至体外时，由于缺乏细胞内复杂的环境调控，例如反应物的持续消耗和反应条件的动态调整，体外反应系统的性能往往不如细胞内。

体外生物合成的主要挑战之一是反应的热力学限制。在封闭的体外环境中，反应达到平衡会导致底物的转化率受限。而在细胞内，由于代谢通路的动态调控，例如后续反应的持续进行或产物的输出，细胞能够维持反应的持续流动，从而避免反应平衡的出现。此外，细胞内的反应环境通常具有高度的异质性和粘稠性，其中包含了多种化学物质，这些化学和静电相互作用导致了非理想溶液行为，这不仅影响酶的反应动力学，还可能改变催化反应的驱动力，如反应的吉布斯自由能变化。

另一个重要的挑战是不同酶在级联反应中对反应条件的需求存在差异。例如，某些酶可能需要特定的辅因子浓度或氧气水平，而这些条件在体外反应系统中难以同时满足。此外，生理浓度的维持对于实现高效的生物合成至关重要，而许多酶会受到底物或辅因子的变构调节，高浓度的底物或产物可能导致酶的抑制。因此，设计一个高效的体外反应系统，需要精确地平衡酶的活性与反应条件，同时还要避免不必要的副反应或代谢通路的激活。

为了解决这些挑战，反应工程策略被广泛应用。反应工程通常包括调整反应体系或反应器的设置。在设计级联反应时，由于不同酶对pH、温度和反应物浓度的反应条件可能存在差异，因此需要寻找一个重叠的反应窗口。此外，反应器的类型也会影响级联反应的效率。例如，批式反应器通常用于级联反应，因为它们允许灵活调整酶的比例。相比之下，流动反应器（如插管式反应器）通常用于单步反应，但在某些情况下，如生产天然产物伪胆素A时，流动反应器也被成功应用。

反应工程的一个重要方面是反应介质的优化。在体外反应中，反应物通常以较高的摩尔浓度使用，而溶剂的性质和浓度对酶的活性和选择性具有重要影响。因此，许多研究尝试通过改变反应介质，例如使用水混溶的有机溶剂或离子液体，来提高反应的效率。此外，一些研究还利用微水反应系统（MARS）或水不混溶的有机溶剂，以改善反应物的溶解性，并同时影响酶的反应特性。

在某些情况下，反应介质的改变不仅有助于反应物的溶解，还能影响酶的立体选择性。例如，在不同溶剂中进行酯交换反应时，某些酶可能表现出不同的区域选择性。这表明，通过调整反应介质，可以显著改变酶的反应特性，从而优化级联反应的性能。此外，溶剂的改变还能影响酶的稳定性，如某些酶在特定溶剂中表现出更高的活性。

为了克服反应平衡的问题，反应工程还采用了不可逆反应步骤或连续去除产物的方法。不可逆反应步骤可以消耗副产物，从而推动反应向产物方向进行。而连续去除产物（即在位产品去除，ISPR）不仅可以减少产物对酶的抑制作用，还能降低产物的损失，如因蒸发或与其他反应组分的交叉反应。在实际应用中，提取到另一个相（如水不混溶的有机溶剂）或通过吸附方式固定在水不溶性载体上，是较为便捷的在位产品去除方法。

在某些级联反应中，反应物之间的不相容性也会影响整体的反应效率。例如，某些反应物可能对酶产生抑制作用，或者与酶发生非特异性相互作用。为了克服这些不相容性，反应工程采用了分步反应或空间分隔的策略。分步反应意味着在不同的时间点添加反应物或酶，从而防止早期反应步骤的抑制，同时优化后续反应的条件。空间分隔则意味着将某些反应步骤分开进行，例如通过中间提取步骤来分离反应中间体，这种方法在生产天然产物进入松（Enterocin）时得到了成功应用。

此外，酶的浓度平衡也是提高体外反应效率的重要因素。通过调整酶的浓度，可以优化反应的通量，从而提高产物的产率。然而，目前许多研究仍然依赖于实验方法，如滴定实验，来确定最佳的酶比例。近年来，随着统计方法的发展，这些实验方法变得更加高效和系统化。例如，在研究进入松的合成过程中，研究人员不仅确定了最佳的酶比例，还通过优化缓冲液条件解决了中间产物积累的问题，从而实现了底物的完全转化。

在某些情况下，反应工程还结合了计算方法。例如，通过分子动力学（MD）模拟，可以预测反应物与酶的相互作用，并优化反应条件。MD模拟允许研究人员观察分子在时间上的运动，并分析溶剂对反应的影响。这种方法对于理解反应体系的动态行为，以及优化反应条件具有重要意义。然而，MD模拟通常需要较高的计算资源，因此在某些情况下，研究者采用混合方法，如量子力学-分子力学（QM/MM）方法，来同时研究化学反应和分子动力学行为。

随着机器学习（ML）技术的发展，计算方法在生物合成研究中的应用也变得更加广泛。ML工具可以用于预测酶的结构，分析反应物与酶的结合特性，并优化反应条件。例如，AlphaFold等ML工具已经被成功应用于预测蛋白质的三维结构，从而为酶的结构和功能研究提供了新的视角。此外，ML方法还可以用于优化反应条件，例如通过分析大量实验数据，预测最佳的反应介质或酶比例。

在研究生物合成级联时，计算方法不仅有助于理解反应机制，还能预测反应物的结合特性，以及优化反应条件。例如，在研究进入松的合成过程中，研究人员利用MD模拟分析了酶的动态行为，并优化了反应条件。而在其他研究中，例如研究单乙酰基丙二酸辅酶A（DEBS-AT6）的结合特性时，MD模拟也被用来预测酶的结构变化，并优化反应条件。

综上所述，体外生物合成虽然面临诸多挑战，但通过反应工程和计算方法的结合，可以显著提高其效率。反应工程提供了优化反应条件和反应介质的方法，而计算方法则为理解酶的结构、反应机制和反应物的相互作用提供了新的工具。随着技术的不断发展，这些方法将在未来的生物合成研究中发挥越来越重要的作用。