“修剪树木”：在系统发育研究中，比较5S-IGS核糖体DNA高通量测序中的OTUs和ASVs

《Ecology and Evolution》：Pruning the Tree: Comparing OTUs and ASVs in High-Throughput Sequencing of 5S-IGS Nuclear Ribosomal DNA in Phylogenetic Studies

Amplicon测序的5S核糖体RNA基因簇在系统发育和资源遗传学中有重要应用，但数据冗余和计算复杂度是主要挑战。本研究比较了MOTHUR和DADA2两种工具在7种欧洲山毛榉物种的5S-IGS测序数据处理中的效果，发现DADA2能高效减少冗余序列（降低80%以上），同时保留所有主要进化信号和基因多样性类型。尽管MOTHUR生成的OTU在低丰度序列捕获上更具优势，但DADA2的ASV在系统发育树构建、网络拓扑分析和地理分化检测中表现更优，且计算效率更高。研究证实DADA2在处理复杂多态性基因数据时更可靠，推荐用于杂交、多倍体化等进化机制研究。

　　### 解读：高通量测序中OTU与ASV方法在5S-IGS基因组分析中的应用比较

在现代生物学研究中，高通量测序（High-Throughput Sequencing, HTS）已经成为解析物种遗传资源、追踪其进化路径的重要工具。特别是针对核糖体DNA（rDNA）的5S非转录间基因区（5S-IGS），其高度的变异性和重复性使其成为研究物种多样性、进化过程和分类学关系的宝贵数据来源。然而，HTS技术所获得的数据量往往非常庞大，处理这些数据不仅面临计算复杂性的问题，还容易产生冗余、错误和难以管理的数据结构。因此，如何高效地对这些数据进行预处理，从而减少数据量而不丢失关键的分子系统发育信息，成为推动下游分析和更深入研究的重要课题。

本研究聚焦于两种常用的生物信息学工具——MOTHUR和DADA2——在5S-IGS基因组数据处理中的表现。通过比较这两种方法生成的操作分类单元（Operational Taxonomic Units, OTUs）和扩增子序列变异（Amplicon Sequence Variants, ASVs），研究人员希望评估它们在量化和质化方面对样本数据集的影响，以及它们在构建系统发育树和识别诊断性5S-IGS变体类型上的能力。研究结果表明，DADA2生成的ASVs在保留物种主要变异类型的同时，显著减少了代表性序列的数量，从而提高了数据处理的效率和清晰度。相比之下，MOTHUR生成的OTUs虽然在某些情况下能更全面地反映样本的多样性，但其产生的冗余序列和低支持度的分支结构可能会影响系统的准确性。

#### 数据的多样性与冗余问题

在进行5S-IGS扩增子测序后，所获得的数据集通常包含大量重复的序列读数。这些重复可能源于实验过程中的随机误差、人为操作或生物学上的真实变异。MOTHUR采用基于相似度阈值的聚类方法，通常将序列相似度设定为97%，以识别OTUs。然而，这种方法在处理5S-IGS数据时存在一定的局限性。由于该区域的高变异性和重复性，MOTHUR生成的OTUs往往包含大量稀有且不具代表性的序列，这些序列在系统发育树中可能表现为低支持度的分支或扁平的末端子树，从而增加分析的复杂性和不确定性。

相比之下，DADA2采用了一种基于机器学习的错误模型构建方法，通过计算测序过程中的误差概率，能够更精确地识别真实的序列变异，即使这些变异仅存在于少数读数中。这种方法生成的ASVs在保持分子系统发育信号的同时，显著减少了序列数量，使得系统发育树的构建更加高效。例如，在本研究中，DADA2生成的ASVs数量仅为MOTHUR OTUs的1/250左右，但其仍能准确识别所有已知的5S-IGS变体类型，包括主要的谱系（lineages）和子谱系（sublineages）。这一结果表明，DADA2在保留生物信息的同时，有效减少了数据冗余，从而提高了分析的准确性和可操作性。

#### 系统发育树的构建与比较

构建系统发育树是解析物种进化关系的重要手段，但传统的OTUs方法在处理大规模数据时存在明显的挑战。由于OTUs的数量庞大，系统发育树的构建往往需要处理大量的末端节点（tips），这不仅增加了计算负担，还可能导致树的结构变得复杂和难以解读。此外，低支持度的分支（low support branches）和大量重复的末端子树（comb-like subtrees）会干扰对真实进化关系的识别。

在本研究中，DADA2生成的ASVs在构建系统发育树时表现出更高的效率和清晰度。通过比较不同方法生成的树结构，研究人员发现，DADA2的ASV数据集能够更准确地反映已知的5S-IGS谱系和变体类型。此外，DADA2的ASVs还能够捕捉到一些在MOTHUR数据集中被遗漏的稀有且具有分化特征的序列变体，例如在台湾特有物种Fagus hayatae中发现的Hayatae A、B1–B3等变体类型。这些变体的识别对于理解物种的分化历史和进化路径具有重要意义。

MOTHUR生成的OTUs在某些情况下仍具有其独特的优势。例如，在处理低多样性样本时，MOTHUR的OTUs能够更全面地反映样本的遗传结构，包括一些可能被DADA2忽略的稀有变体。然而，这种全面性往往伴随着更高的计算成本和数据冗余，这在处理大规模数据集时可能成为限制因素。因此，在研究目标需要高分辨率和精确性的情况下，DADA2的ASVs可能是一个更优的选择。

#### 5S-IGS基因组的复杂性与系统发育信号

5S-IGS基因组的复杂性主要体现在其高度的变异性和重复性上。在被调查的七种山毛榉（Fagus spp.）样本中，研究人员发现这些物种的5S-IGS序列存在显著的谱系分化，包括主要的A、B、C谱系以及一些可能的进化中间类型（如Lineage I和Lineage O）。这些谱系之间的分化模式反映了山毛榉在进化过程中经历的复杂事件，如全倍体化（autopolyploidisation）、杂交（hybridisation）和基因流（gene flow）等。

DADA2生成的ASVs在捕捉这些系统发育信号方面表现出色。例如，在构建系统发育网络（Neighbour-Net）时，DADA2的ASVs能够更清晰地反映出样本之间的遗传距离和分化模式。相比之下，MOTHUR生成的OTUs虽然在某些情况下能够保留更多的序列变体，但这些变体中许多是由于测序误差或人为聚类导致的假阳性，因此在系统发育分析中可能引入噪声。此外，MOTHUR的OTUs还可能导致系统发育树的结构变得复杂，增加了解读的难度。

#### 应用前景与研究意义

本研究的结果对未来的5S-IGS基因组分析具有重要的指导意义。首先，DADA2生成的ASVs在减少数据冗余的同时，能够更准确地反映物种的系统发育关系，这使得其在处理大规模数据集时更具优势。其次，DADA2的ASVs能够有效捕捉到稀有但具有分化意义的序列变体，这对于研究物种的进化历史和遗传多样性具有重要意义。例如，在处理台湾特有物种Fagus hayatae时，DADA2能够识别出多个新发现的变体类型，这些变体可能与已知的谱系存在一定的关联，但尚未被充分研究。

此外，DADA2的ASVs还具有更好的可比性和可重复性，使得不同研究之间的数据整合更加方便。这在多物种、多地区的比较研究中尤为重要，因为数据的标准化和可比性是推动科学发现的关键。相比之下，MOTHUR生成的OTUs由于其聚类方法的限制，可能在不同研究之间缺乏一致性，从而影响研究的可重复性和结果的可靠性。

#### 未来研究方向

尽管DADA2在处理5S-IGS数据时表现出色，但其在某些特定情境下可能仍有局限。例如，在需要全面评估物种多样性时，MOTHUR的OTUs可能提供更丰富的信息。因此，未来的基因组研究可能需要结合两种方法的优势，以实现更全面的分析。具体而言，可以采用DADA2生成的ASVs进行高精度的系统发育分析，同时保留部分MOTHUR生成的OTUs以捕捉稀有但重要的遗传变异。

此外，随着测序技术的不断发展和样本规模的扩大，对数据处理方法的需求也在不断提高。因此，未来的研究应进一步探索DADA2在处理其他类型的基因组数据（如16S rDNA、ITS等）中的表现，并评估其在不同生态和地理背景下的适用性。这将有助于推动基因组学在生物多样性研究中的应用，特别是在处理复杂生态现象（如杂交、全倍体化和基因漂变）时。

#### 总结

综上所述，本研究通过对比MOTHUR和DADA2在处理5S-IGS基因组数据时的表现，揭示了两种方法在数据处理效率、系统发育信号捕捉能力和多样性评估方面的差异。DADA2生成的ASVs在减少数据冗余、提高计算效率和准确识别系统发育关系方面具有显著优势，特别是在处理大规模数据集和复杂进化现象时。然而，MOTHUR生成的OTUs在某些情况下仍能提供更全面的遗传信息，因此在特定研究目标下仍具有其独特的价值。未来的研究应结合这两种方法的优点，以实现更全面、准确和高效的基因组分析。