样本间变异性显著影响环境DNA(eDNA)定量分析并挑战物种丰度评估的精确性

本研究通过系统分析环境DNA(eDNA)定量过程中的变异来源，发现样本间变异占总变异的75.4%，而技术性变异仅占5%。研究证实增加样本体积（300mL）、使用大孔径滤膜（5μm）和混合采样能显著提高eDNA定量精度，为物种丰度（R2>0.8）评估提供了关键方法学优化方案。

　　

ABSTRACT

环境DNA（eDNA）技术正逐渐成为物种丰度评估的重要工具，但在实际应用中，即使处于相同环境条件下，个体水样间的eDNA浓度仍存在显著变异。本研究以林蛙（Lithobates sylvaticus）蝌蚪为模型，通过中宇宙实验系统解析了eDNA定量过程中的变异来源。研究发现样本间变异占总变异的75.4%，而技术重复（包括提取和qPCR重复）仅贡献约5%的变异。通过优化采样方法（如增加样本体积至300mL、使用5μm大孔径滤膜、采用空间混合采样等），可显著提高eDNA定量的精确性。该研究揭示了微观尺度eDNA分布的不均匀性对丰度评估的重大影响，为优化eDNA监测方案提供了实证依据。

1 Introduction

环境DNA（eDNA）技术在水生生态系统监测中迅速发展，特别是在物种存在性检测方面已形成标准方法。近年来，其应用已扩展到物种丰度（包括种群大小、密度和生物量）的非侵入式评估领域。理论上，较大种群应产生更多eDNA，实验室研究也确实在多物种中观察到生物量与eDNA浓度间的强相关性（R²>0.8）。然而在自然条件下，这种关系变得复杂，限制了该技术的广泛应用。

实验室研究中，即使是在相同条件下培养的个体或种群，其eDNA浓度也经常出现数量级水平的差异。这种变异可能来源于生物本身（如个体间脱落差异）和技术流程（如采样和处理步骤）。虽然许多研究致力于优化采样策略以提高稀有物种的检出率，但针对提高eDNA定量精确度的研究仍较为缺乏。

本研究聚焦于一个基础且实际的问题：在小型系统中，单次水样采样对eDNA浓度估计的代表性如何？通过从饲养林蛙蝌蚪的中宇宙系统采集重复水样，系统分析了采样、提取和qPCR重复等环节对eDNA定量变异的影响。

2 Materials and Methods

2.1 Sources of Variation in eDNA Quantification

从三个中宇宙系统（各容纳30-40只蝌蚪）连续两天采集15个重复水样，每个样本100mL从水面中心点采集。使用0.45μm混合纤维素酯滤膜过滤，滤片保存在95%乙醇中。采用Qiashredder/DNeasy Blood and Tissue Kit方法提取DNA，使用物种特异性qPCR assay进行定量分析。

通过负二项混合模型分析变异来源，固定效应为采样事件（中宇宙+日期），随机效应为样本重复ID。使用内部对照DNA（spiked in at lysis步骤）评估提取效率变异，通过Cq值差异计算提取相关变异幅度。

2.2 Sampling Methods and Sample-To-Sample Precision

比较了七种采样方法的改进方案（表1）：硅胶干燥保存、增加样本体积至300mL、使用5μm大孔径滤膜、单点混合采样（3勺）、多点混合采样（3个位点）、样本倒置混合以及独立处理滤膜两半。所有样本使用相同的qPCR分析方法，300mL样本的结果按比例换算为100mL基准进行比较。

采用广义最小二乘法模型分析不同方法的变异差异，通过bootstrap计算95%置信区间评估方差显著性，使用Tukey校正进行均值比较。

3 Results

3.1 Sources of Variation in eDNA Quantification

重复样本间eDNA浓度存在显著变异，差异幅度达2-135倍，变异系数为20.0%-96.9%。混合模型分析显示，采样事件（不同中宇宙）仅解释19.5%的变异，样本间变异占75.4%，剩余变异（含qPCR技术重复）仅占5.0%。

内部对照DNA的Cq值变异为1.34个循环，对应2.53倍的eDNA拷贝数差异，仅占总体观测变异（329.18倍）的很小部分，表明提取过程引入的变异可忽略不计。

3.2 Sampling Methods and Sample-To-Sample Precision

不同采样方法对eDNA定量精确性有显著影响。第一组方法中，5μm滤膜、单点混合采样和硅胶保存显示出最低变异（残差标准差25.08-62.31拷贝），标准方法变异最高。增加样本体积至300mL能显著降低变异（95%CI:6.80-20.88拷贝）。

均值比较发现，5μm滤膜和硅胶保存样本的eDNA浓度显著低于单点混合采样（p<0.05），表明大孔径滤膜虽提高精确性但可能降低回收率。滤膜两半独立处理未见系统性差异（p=0.65），证实提取过程的一致性。

4 Discussion

本研究发现样本间变异是eDNA定量不确定性的主要来源（75.4%），远高于技术性变异。这种变异可能源于eDNA在微观尺度的不均匀分布（如聚集形成颗粒、细胞内外状态差异等）。即使在190L的小型中宇宙系统中，暴露于自然风力搅拌和生物活动，eDNA仍呈现高度空间异质性。

方法学优化显示：增加样本体积、使用大孔径滤膜、单点混合采样能有效提高精确性。但需注意权衡——大孔径滤膜虽降低变异但可能减少eDNA捕获量，影响丰度评估的准确性。值得注意的是，多点混合采样并未改善精确性，表明简单增加空间取样点不能解决微观异质性问题。

这些发现对eDNA丰度评估研究具有重要启示：首先，必须充分考虑样本间变异对统计功效的影响；其次，采样方案需根据研究目标（精确性vs准确性）进行优化；最后，在自然环境中，可能需要结合多种策略（如增加样本体积+多点采样）来提高评估可靠性。

Author Contributions

M.B.P., C.S.G., J.L.B.共同设计采样方案和分析方法；T.A.G.R., E.J.C.提供实验系统和动物养护；M.B.P.完成样本采集、实验操作、数据分析和文稿起草；所有作者参与最终文稿审阅编辑。

Acknowledgments

感谢Nicole Dahrouge（康涅狄格大学）、Lex Dulmage（华盛顿州立大学）在实验系统维护方面的贡献，以及Mary Sterling, Alex Duke在样本采集和实验协助方面的工作。资金支持来自美国国防部SERDP项目RC19-1131、NSF DEB 1754474和1754404，以及美国农业部McIntire-Stennis项目1018967。

Conflicts of Interest

作者声明无利益冲突。