超强潮汐河口鱼类多样性监测中环境DNA（eDNA）过滤方法的性能比较与优化研究

本研究系统比较了四种环境DNA（eDNA）过滤方法（0.45μm、1.2μm、5μm滤膜及被动式metaprobe采样器）在超强潮汐河口生态系统鱼类多样性监测中的性能。结果表明，0.45μm滤膜在物种丰富度检测（39种）和检测一致性方面表现最优，而新型被动采样器metaprobe在短时部署下仍能检测35种物种，展现出与主动过滤方法相当的潜力。该研究为河口生态系统eDNA监测标准的建立提供了关键数据支撑，对全球类似生态系统的生物多样性监测具有重要指导意义。

　　

1 引言

河口生态系统作为淡水和海水交汇的过渡带，具有复杂的水文动力学特征和强烈的环境梯度变化，传统鱼类监测方法如刺网捕捞、电捕鱼和拖网调查等存在侵入性强、成本高且效率低下的局限性。环境DNA（eDNA）技术通过从水样中捕获生物体释放的遗传物质，已成为水生生物多样性监测的高效工具，但其在河口等高动态环境中的应用仍面临标准化不足和过滤方法优化的挑战。

2 方法与材料

2.1 研究区域

研究选址于英国西北部的默西河口（Mersey Estuary），该河口潮差高达10米，具有显著的盐度梯度和沉积物再悬浮特征。研究在河口上段（淡水区）、中段（浑浊带）和下段（海洋区）共设置10个采样点，以覆盖不同的生境类型和环境条件。

2.2 eDNA过滤方法

研究比较了四种过滤方法：三种主动式滤膜过滤（0.45μm Sterivex、1.2μm Whatman、5μm KX Nylon）和一种被动式metaprobe采样器。每种方法在每个采样点设置三个重复，共计360个样本。主动过滤使用60mL注射器手动推注水样，记录过滤体积；metaprobe则通过附着医用纱布 passively 吸附eDNA，部署时间为5分钟。

2.3 DNA提取与扩增

DNA提取在专用洁净室中进行，针对水样和metaprobe样本分别采用改良的Mu-DNA protocol和土壤DNA提取方法。使用Tele02引物扩增12S rRNA基因片段（~167 bp），以避免MiFish-U/E引物在咸水环境中扩增非目标片段的干扰。PCR产物经纯化、定量和文库构建后，使用Illumina MiSeq平台进行测序。

2.4 生物信息学分析

采用OBITools流程处理测序数据，包括质量过滤、去噪、去嵌合体和聚类为分子操作分类单元（MOTU）。使用定制化的英国鱼类参考数据库（Meta-Fish-Lib v255）进行物种注释，设定98%相似度阈值。通过严格过滤去除低丰度序列（<5 reads）和潜在污染物，确保数据可靠性。

2.5 统计分析

通过Kruskal-Wallis检验和Dunn事后比较分析不同过滤方法的物种丰富度差异；采用稀疏外推曲线（rarefaction/extrapolation curves）评估采样努力量；使用广义线性混合模型（GLMM）分析方法和生境分区对物种检测的影响；并基于占据模型（occupancy model）计算目标物种的检测概率。

3 结果

研究共获得6,114,309条高质量序列，鉴定出44种鱼类物种。0.45μm滤膜检测到最高物种丰富度（39种），其次为metaprobe（35种）、1.2μm（34种）和5μm滤膜（33种）。统计分析表明，0.45μm滤膜在各类生境中均表现出最稳定的检测性能，且与过滤体积呈显著正相关（Pearson’s R=0.73, p<0.001）。经标准化体积校正后，三种主动过滤方法间的差异不再显著，但河口上段的物种丰富度仍显著高于其他区域。目标物种（欧洲鳗鲡、西鲱和粗鳞鳊）的检测概率分析显示，0.45μm滤膜仅需3–5次重复即可达到95%的检测置信度。

4 讨论

4.1 eDNA过滤方法性能

0.45μm滤膜因其独特的圆柱形设计和较大的悬浮颗粒容纳空间，在高效过滤的同时减少了堵塞风险，成为河口环境中最可靠的监测工具。尽管metaprobe无法量化实际过滤水量，但其在短时部署下仍能检测80%的物种，展现出被动采样技术在标准化和可操作性方面的潜力。研究还发现，滤膜孔径增大（5μm）可能导致小片段DNA丢失，从而降低物种检测效率。

4.2 技术挑战与实用性

河口环境的高浊度和沉积物负荷对过滤方法提出严峻挑战。metaprobe虽避免了堵塞问题，但其依赖3D打印设备和乙醇储存方案，可能限制其在资源有限地区的应用。此外，潮汐驱动的水体运动可能导致eDNA跨区域传输，引发假阳性检测，需结合水动力模型进一步验证物种分布的准确性。

5 结论

本研究证实0.45μm滤膜是河口鱼类eDNA监测的最优选择，尤其在稀有物种（如大西洋鲑和粉红鲑）检测方面具有显著优势。metaprobe作为新兴被动采样技术，在简化 fieldwork 和降低设备依赖方面展现出应用前景。研究成果为全球河口生态系统的eDNA监测策略提供了实证依据和方法学支撑。

作者贡献与致谢

研究由A.D.M.和I.C.牵头资助，J.M.J.负责野外采样、实验室工作和数据分析。所有作者共同参与论文撰写与修订。项目获得默西网关环境信托基金、索尔福德大学和班戈大学联合资助。