μCeta：一种用于环境DNA宏条形码技术的鲸类特异性引物组，实现非目标脊椎动物的最小扩增

本文开发并验证了新型鲸类特异性引物组μCeta，该引物靶向线粒体12S rRNA基因的267 bp区域，能高效检测鲸类环境DNA（eDNA），同时最大限度减少对非目标物种（如鱼类和人类）的扩增，为海洋生物多样性监测和鲸类保护提供了可靠、非侵入性的工具。

　　

引言

生物多样性监测对于理解和保护生态系统动态及物种分布至关重要，尤其是在人类活动和气候变化的影响下。鲸类作为海洋生态系统的关键指示物种，面临日益严重的人类活动威胁，因此迫切需要开发有效且非侵入性的监测方法。环境DNA（eDNA）分析作为一种新兴技术，通过从环境样本中提取DNA并进行宏条形码分析，能够同时检测多个物种，为水生和陆地环境中的生物多样性监测提供了高效、灵敏且成本低廉的方法。

鲸类包括所有鲸、海豚和鼠海豚物种，是海洋环境中的标志性大型动物，对海洋生态系统的功能和服务具有重要贡献，例如碳封存、营养循环和生态旅游。然而，许多鲸类物种受到人类活动和气候变化的严重威胁，超过四分之一的物种被列为受威胁物种。传统的监测方法，如视觉普查、声学调查和卫星图像分析，虽然提供了宝贵的数据，但往往成本高昂、劳动密集，且受天气条件和物种行为限制。因此，eDNA分析作为一种补充工具，具有显著优势，能够检测即使已经离开调查区域的鲸类，且无需直接与活体动物互动。

材料与方法

本研究旨在开发并验证鲸类特异性eDNA宏条形码引物组，以最小化非目标物种的扩增。首先，从公共数据库中检索了71种鲸类的线粒体基因组序列，以及牛、野猪、小鼠、猫、狗和人类等其他哺乳动物的线粒体基因组，用于评估引物的特异性。通过MAFFT在线工具进行序列比对，并利用DECIPHER包和手动检查设计了20个候选引物组，这些引物靶向12S rRNA、16S rRNA和NAD3基因区域。

在硅学评估中，使用USEARCH进行硅学PCR，分析引物组的预期扩增子长度、扩增物种数量以及区分近缘物种的能力。评估的关键指标包括引物与模板DNA的错配数量、扩增物种范围以及编辑距离计算。基于硅学评估结果，选择了四个引物组进行实证验证：Mu31F/Dc320R（后命名为μCeta）、Dc671F/Dc1015R、Mu2084F/Dc2438R和Mu9459F/Mu9822R。

实证验证分为两部分：首先使用从搁浅个体或水族馆获得的19种鲸类组织提取的DNA进行测试；其次，收集水族馆池水和香港沿海水域的海水样本，进行eDNA提取和宏条形码分析。水样使用Sterivex滤器过滤，DNA提取采用DNeasy Blood and Tissue试剂盒，并进行两轮PCR扩增和Illumina测序。序列数据处理使用DADA2进行ASV分析，并通过QCauto方法和BLAST搜索进行物种鉴定。

结果与讨论

硅学评估：扩增子长度与特异性

硅学评估显示，所有候选引物组均能有效扩增鲸类DNA，且与大多数鲸类序列的错配不超过一个。其中，μCeta引物组（Mu31F/Dc320R）在扩增鲸类DNA的同时，与人类DNA存在四个错配，与非目标脊椎动物（如鱼类、鸟类、爬行动物和两栖动物）的错配较多，表明其具有较低的扩增非目标物种的可能性。此外，μCeta的扩增子长度为267 bp，适合短读长测序，且具有较高的物种区分能力。

组织DNA扩增

使用19种鲸类组织DNA进行实证验证，结果显示μCeta和Mu2084F/Dc2438R成功扩增了所有物种的DNA，而Dc671F/Dc1015R和Mu9459F/Mu9822R分别未能扩增一种和四种物种。Mu9459F/Mu9822R的扩增失败可能与其较高的简并碱基数量以及样本DNA降解有关。

水族馆池水样本的eDNA检测

在水族馆池水样本中，所有四个引物组均成功检测到了池中饲养的鲸类物种，如伪虎鲸（Pseudorca crassidens）和宽吻海豚（Tursiops truncatus）。μCeta引物组在物种鉴定方面表现最佳，能够为所有检测到的序列分配正确的物种名称，而其他引物组在某些情况下无法区分近缘物种，导致部分序列被标记为“未识别的海豚科”。

此外，检测到了某些非池中饲养的鲸类物种eDNA，这可能是由于水循环导致的eDNA迁移或来自饵料鱼的污染。这些结果强调了eDNA宏条形码技术的高灵敏度，同时也突出了在采样和实验过程中避免交叉污染的重要性。

非目标eDNA检测

在香港沿海水样的初步测试中，μCeta、Dc671F/Dc1015R和Mu9459F/Mu9822R几乎仅检测到鲸类eDNA，而Mu2084F/Dc2438R则扩增了大量非目标哺乳动物（如牛、猪和人类）的eDNA。与已报道的引物组（如MiMammal和Ceto2）相比，μCeta在特异性方面表现优异，能够最小化非目标物种的扩增。

香港水域的鲸类eDNA检测

在香港水域的实地应用中，μCeta引物组成功检测到了濒危物种中华白海豚（Sousa chinensis）的eDNA，样本采集位置距离观测个体约30米。两个海水样本中分别检测到了1,799,357和1,446,733条中华白海豚的序列读长，且未发现非鲸类eDNA，表明μCeta在自然环境中具有高灵敏度和特异性。此外，在香港东部水域的样本中还检测到了同样列为“易危”物种的印太江豚（Neophocaena phocaenoides）的eDNA。

未来方向

尽管μCeta引物组在本次研究中表现优异，但其在更广泛鲸类物种和不同海洋环境中的适用性仍需进一步验证。一些鲸类物种（如亚马逊河豚Inia geoffrensis和弓头鲸Balaena mysticetus）与μCeta引物存在较多错配，可能影响扩增效率。未来研究应通过更多实地样本验证μCeta的全球适用性，并探索其与鱼类或其他海洋哺乳动物引物组的多重扩增应用，以提高监测效率。

此外，eDNA宏条形码技术目前无法直接提供物种丰度信息，但通过定量PCR（qPCR）或添加 spike-in DNA 的方法，可以估算eDNA浓度，作为物种丰度的间接指标。长读长测序技术的应用还可能实现基于种内变异的个体识别，从而直接估算个体数量。

结论

本研究成功开发并验证了鲸类特异性引物组μCeta，该引物组在硅学和实证测试中均表现出高灵敏度、强物种区分能力和低非目标扩增率。在香港水域的实地应用中，μCeta成功检测到了中华白海豚和印太江豚的eDNA，证明了其作为非侵入性监测工具的有效性。μCeta的应用有望支持全球鲸类保护行动和海洋生态系统管理，未来需进一步扩大其验证范围和应用场景。