丰盈而异常的辅助性T细胞应答：揭示人类与小鼠黏膜念珠菌病的免疫失衡机制

本综述深入探讨了STAT1功能增益（GOF）突变患者中，白色念珠菌（Candida albicans）特异性T辅助细胞（Th）应答虽数量正常但功能异常（偏向Th1/Th2极化）的现象。研究通过人源样本和小鼠模型证实，仅Th17细胞能有效清除黏膜感染，而Th1/Th2细胞无效，且Th2细胞通过分泌IL-4抑制Th17功能，从而损害保护性免疫。该发现为慢性黏膜皮肤念珠菌病（CMC）的免疫治疗（如IL-4中和策略）提供了新思路。

　　

1 引言

白色念珠菌（Candida albicans）是一种常驻于黏膜表面的共生真菌，但在免疫受损个体中可转化为病原体，引起浅表性疾病（如外阴阴道念珠菌病VVC、口咽念珠菌病OPC）或危及生命的侵袭性感染。临床与实验证据强调，Th17介导的免疫应答在抗白色念珠菌感染中起核心保护作用。原发性免疫缺陷（PIDs）患者中，影响17型免疫的关键基因突变与慢性黏膜皮肤念珠菌病（CMC）密切相关。此外，接受IL-17抑制剂治疗的患者念珠菌感染率升高，进一步印证了Th17通路的重要性。小鼠模型中，IL-17通路组件（如IL-23、IL-17受体、衔接蛋白Act1）的缺陷导致对口腔和皮肤念珠菌病的易感性。

尽管健康个体中对白色念珠菌的记忆CD4⁺ T细胞应答功能多样，包含Th17、产生IFN-γ的CCR6⁺ Th1*细胞及较低频率的Th1和Th2细胞，但非Th17亚群（尤其是Th1和Th2）在保护或致病中的作用仍不明确。本研究聚焦于STAT1功能增益（GOF）突变所致CMC患者，其特点是反复细菌、病毒和真菌感染。这些患者表现出数量正常但功能异常的白色念珠菌特异性T细胞池，偏向Th1和Th2极化，而Th17细胞显著减少。

2 结果

2.1 STAT1-GOF患者的白色念珠菌特异性Th应答定量保留但表型改变

通过对外周血单核细胞（PBMCs）的分析，STAT1-GOF患者记忆CD4⁺CD45RA^– T细胞亚群分布发生显著偏移：Th1细胞数量约为对照的两倍，Th17细胞不足对照的一半。患者CD4⁺ T细胞CCR6表达明显降低，此现象未见于其他白细胞类型。此外，STAT1-GOF患者来源的Th17克隆产生IFN-γ的能力显著高于健康个体，但产生IL-17和IL-22的能力未受明显损害。

采用“T细胞文库” assay检测白色念珠菌特异性细胞频率，发现患者与健康个体间应答总体强度相当，但应答分布截然不同：健康个体以Th17为主导，而STAT1-GOF患者以Th1和Th2为主，导致Th1/Th17和Th2/Th17比率高度倾斜。

2.2 STAT1-GOF患者对白色念珠菌免疫优势抗原的应答发生偏斜

为探究应答偏斜是否源于抗原识别差异，研究首先基于文献筛选了80个白色念珠菌蛋白，合成其MHC-II结合预测肽段（15聚体，重叠10个氨基酸），并通过体外增殖实验排名免疫优势抗原。前15个肽池（在至少80%个体中诱导>20%增殖）被合并为“超级池”，与已知免疫优势抗原MP65、HYR1及SAP4-6肽段共同用于评估患者和健康对照的记忆Th细胞应答。

T细胞文库 assay显示，患者与对照对超级池的应答频率相当，但超级池特异性T细胞的亚群分布倒置：STAT1-GOF患者Th1和Th2应答显著更高，Th17应答更低。对MP65、HYR1和SAP4-6的应答强度在两组间相似，但亚群分布同样倒置：对照以Th17和Th1型为主（Th17 + Th1>> Th2 + Th1），而患者以Th1和Th2型为主（Th1 + Th2 >> Th1* + Th17）。表明尽管抗原识别和启动 intact，但T细胞极化存在质的缺陷。

2.3 T细胞免疫在小鼠黏膜念珠菌病模型中对长期保护至关重要

为在体内验证上述发现，研究建立了白色念珠菌阴道黏膜感染模型。野生型（WT）和μMT（B细胞缺失）小鼠能有效清除感染，而Rag2^–/–Il2rg^–/–小鼠（缺乏B、T淋巴细胞、固有淋巴细胞ILCs和NK细胞）迅速体重下降并在30天内死亡，所有受检器官均显示高真菌负荷。Cd3e^–/–小鼠（T细胞缺失）初期控制感染，但约两个月后开始体重下降并很快死亡，阴道内真菌持续存在达90天，并播散至胃和肠道。传播可能通过食粪或理毛行为发生，这一点从与感染鼠共居的未感染鼠肠道中回收真菌得到证实。

这些结果表明，ILCs（单独或与T细胞协同）对黏膜白色念珠菌感染的早期保护至关重要，而T细胞对长期真菌控制不可或缺。

2.4 抗黏膜念珠菌病的长期保护需要抗原特异性Th17细胞

将Hector小鼠（携带白色念珠菌ADH1来源C2肽特异性转基因TCR）的初始T细胞过继转移至Cd3e^–/–小鼠，完全恢复了其对阴道白色念珠菌感染的保护能力，表现为存活率提高和阻止真菌向胃肠道播散。表型分析显示，感染后12天，引流淋巴结（dLNs）中高达60%的过继转移Hector CD4⁺ T细胞分化为Th1/Th17细胞。

随后，将体外极化（Th1、Th2或Th17条件）的Hector效应Th细胞过继转移至Cd3e^–/–小鼠。只有Th17细胞能有效控制感染，而等量Th2细胞转移不仅不能保护，反而加剧疾病进程（显著体重减轻和存活率降低）。Th1细胞提供部分保护，有限制真菌生长和播散的作用。Th17细胞的保护作用具有抗原特异性且依赖IL-17A：转移IL-17A缺陷的Hector Th17细胞（Hector Il17a^–/–）或无关抗原（OVA）特异性OT-II Th17细胞则保护作用消失。缺乏T细胞来源IL-17A时，Ly6C⁺ Gr1^int炎症单核细胞和Ly6C^int Gr1⁺中性粒细胞（抗真菌入侵的关键效应细胞）在dLNs和阴道组织中的募集减少。

这些发现证明，在黏膜感染模型中，抗原特异性、产IL-17A的Th17细胞是长期抗白色念珠菌保护所必需且充分的，而Th1细胞提供有限保护，Th2细胞有害并导致疾病加重。

2.5 Th2细胞通过损害Th17介导的保护而削弱抗白色念珠菌黏膜感染

鉴于Th2重建小鼠疾病加重，以及STAT1-GOF患者中观察到的Th1/Th17和Th2/Th17比率升高，研究推测非Th17细胞可能抑制或抵消Th17细胞的保护功能。通过将Hector Th1、Th2或Th17细胞单独或组合过继转移至Cd3e^–/–小鼠，发现Th17细胞单独应用能在第60天有效控制阴道定植，Th2细胞无效，Th1细胞提供部分控制。Th1细胞的存在不干扰Th17介导的保护，而Th2细胞的加入则完全废除该保护。Th2细胞的 detrimental effect 与其相对Th17细胞的初始丰度成比例，即使在降低的Th2:Th17比率（1:2）下也明显。

细胞计数分析显示，与Hector Th2细胞共转移的小鼠其dLNs（腰部和肠系膜）和阴道组织中Hector Th17细胞和IL-17A⁺ Th17细胞数量显著减少，而与Th1细胞共转移则无此减少。Th2细胞对Th17细胞的负面影响也体现在当其与Th17细胞共转移时，真菌控制被废除。尽管T细胞存在可塑性，但无论Th2细胞存在与否，从dLNs和阴道组织回收的Hector Th17细胞在感染后10天和30天均保持其IL-17A生产能力。

在口咽念珠菌病（OPC）模型中也观察到类似结果：只有单独接收Th17细胞的小鼠成功控制真菌，接收Th2细胞（单独或与Th17共同）的小鼠则失败，且Th2细胞损害Th17细胞产生IL-17的能力。表明Th2细胞通过限制Th17细胞扩增并在某些组织中抑制其效应功能，从而损害黏膜表面的白色念珠菌控制。

2.6 Th2细胞通过分泌IL-4抑制Th17保护功能

体外共培养系统显示，Hector Th2细胞以剂量依赖方式显著减少Hector Th17细胞增殖和IL-17A产生，而Hector Th1细胞或Hector IL-4缺陷Th2细胞无此影响。添加重组IL-4（rmIL-4）同样降低增殖和IL-17A产生，而在Th2-Th17共培养中加入IL-4中和抗体（αIL-4）可恢复Th17增殖并部分恢复IL-17A产生。

体内实验进一步验证：将Hector Th17细胞、Hector Th2细胞或Hector IL-4缺陷Th2细胞单独或组合转移至Cd3e^–/–小鼠。接收Th17细胞单独或与IL-4缺陷Th2细胞组合的小鼠在感染后第60天清除阴道白色念珠菌。在这些小鼠中，Hector IL-17A⁺ Th17细胞在阴道组织中 robustly 扩增并保持IL-17生产能力。类似地，在共转移Hector Th2和Th17细胞的感染小鼠中，用αIL-4治疗显著改善真菌控制，将阴道组织菌落形成单位（CFU）计数降至与单独接收Th17细胞小鼠相当的水平。IL-4中和也恢复了Hector Th17细胞的扩增和IL-17A产生。

表明在白色念珠菌感染期间，Th2细胞来源的IL-4直接抑制Th17细胞，削弱其增殖和IL-17A产生，从而损害真菌控制。此病理效应可通过阻断IL-4逆转，为在Th2介导的Th17功能抑制疾病中恢复保护性免疫提供了潜在治疗途径。

3 讨论

未能产生适当的T细胞应答，导致生成不适合特定病原体的T辅助细胞亚群，可导致无效免疫和病理结果。本研究证明，虽然白色念珠菌特异性Th17细胞对真菌控制至关重要，但替代性Th应答（特别是Th1和Th2）无效，且在Th2情况下可能导致疾病易感性。

STAT1-GOF患者的T细胞识别与健康个体相似的抗原。通过全面抗原指纹分析，揭示了白色念珠菌特异性T细胞应答的相对免疫优势格局，包括HYR1和SAP4-6等抗原，其T细胞识别频率等于或高于参考免疫优势抗原MP65。对前三抗原及代表15个最免疫优势抗原的肽池应答在患者与对照间 quantitatively 相似，但Th分布呈现完全倒置的优势模式：患者主要由Th1和Th2细胞驱动，而健康个体以Th1*和Th17细胞为主。

小鼠模型中获得机制性见解：其中，ILCs和T细胞在遏制真菌播散中均起 essential 作用。Th17细胞必不可少，其保护作用依赖IL-17A，并涉及招募炎症髓系细胞（如中性粒细胞和单核细胞）。Th1和Th2细胞 nonprotective 或 detrimental。尽管IFN-γ生产似乎不对整体应答产生负面影响，甚至有助于某种程度的真菌 containment，但Th2 cells appear detrimental，无论单独或与保护性Th17细胞共同施用均恶化宿主状况。Th2细胞通过分泌IL-4施加负面影响，限制Th17扩增/存活、IL-17生产或两者。

这些发现表明，Th2细胞在CMC患者中可能发挥 detrimental 效应。由遗传改变决定的真菌特异性Th细胞 altered 分布，不仅无法正确应答感染，还影响IL-17A⁺ Th17细胞亚群的保护作用。IL-4中和可能代表一种改善 characterized by白色念珠菌特异性Th细胞亚群 altered 分布的慢性患者疾病结局的推定策略。

4 材料与方法

（此部分为方法学详细描述，涉及人源样本获取、T细胞分选与克隆、T细胞文库 assay、肽段生物信息学分析与合成、功能性 assays、小鼠模型、细胞制备与极化、感染模型、CFU计数、流式细胞术、ELISA及统计学分析等具体实验操作与参数。）

作者贡献与致谢

（明确了各位作者的具体贡献，并致谢参与患者、临床医生及技术支持人员。）

利益冲突

作者声明无利益冲突。