抗SARS-CoV-2刺突蛋白IgA2通过巨噬细胞诱发炎症反应及其免疫代谢机制研究

本研究发现，在严重COVID-19患者中高表达的IgA2亚型抗体可通过FcαRI-Syk信号通路显著增强巨噬细胞的炎症反应，并引发以糖酵解增强和线粒体功能改变为特征的免疫代谢重编程，为靶向IgA2及其下游通路治疗冠状病毒感染引起的过度炎症提供了新思路。

　　

引言

严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）感染可引起2019冠状病毒病（COVID-19），多数病例表现为发热、咳嗽、流涕、头痛和乏力等轻微症状。然而，部分感染者会发展为重症COVID-19，这种疾病恶化通常发生在感染后约1.5周，与血清转换时间相吻合，并与免疫系统对病毒的过度激活密切相关，导致细胞因子风暴和肺部组织损伤。抗SARS-CoV-2刺突蛋白的免疫球蛋白G（IgG）同种型抗体通过过度激活肺泡巨噬细胞，强烈促进这种过度炎症反应。虽然IgG的致病功能已得到广泛研究，但关于IgA（呼吸道中最丰富的免疫球蛋白同种型）的功能知之甚少。

尽管IgA通常被认为不具有炎症性，但本研究表明，抗刺突蛋白IgA可诱导显著的促炎反应。研究人员证明，用抗刺突蛋白IgA免疫复合物联合病毒刺激物刺激巨噬细胞，可放大促炎细胞因子的产生。这种IgA诱导的炎症主要由IgA2驱动，该IgA亚类在重症COVID-19患者血浆中增加。研究确定IgA2诱导的炎症主要依赖于FcαRI-Syk信号传导。从机制上讲，IgA2诱导的炎症与增强的糖酵解和改变的线粒体功能有关，表明存在亚类特异性的免疫代谢重编程。

结果

IgA免疫复合物协同促进人肺泡样巨噬细胞的促炎细胞因子产生

为了评估IgA免疫复合物在重症COVID-19中的炎症潜力，研究人员使用了先前开发的体外人单核细胞衍生巨噬细胞模型，该模型类似于肺泡巨噬细胞，表达肺泡巨噬细胞标志物MARCO和组织驻留巨噬细胞标志物CD163。聚焦于IgA介导的反应，研究人员验证了主要IgA受体FcαRI的表达。巨噬细胞及其单核细胞来源显示清晰的FcαRI表达。

接下来，为了分析它们对IgA的反应性，研究人员用由健康供体混合血清IgA和Toll样受体3（TLR3）激动剂聚肌胞苷酸（Poly(I:C)）形成的免疫复合物刺激这些巨噬细胞。在该模型中，单独用Poly(I:C)刺激模拟感染的初始阶段，而用Poly(I:C)和IgA共同刺激反映血清转换后阶段，该阶段发生在感染后约1.5周，此时重症患者疾病恶化并伴有高度炎症。单独用Poly(I:C)刺激导致促炎细胞因子（如TNF、IL-1β和IL-6）适度增加。虽然单独用IgA刺激也导致轻度炎症，但只有用Poly(I:C)和IgA共同刺激才能显著放大这些巨噬细胞中促炎细胞因子的产生。

这种对IgA诱导的促炎细胞因子产生的协同效应几乎完全依赖于FcαRI和信号分子Syk，因为用FcαRI中和抗体或Syk抑制剂entospletinib阻断可抑制所有评估的标志性细胞因子，包括IL-6和TNF。这些数据表明，当与病毒刺激物结合时，IgA免疫复合物强烈诱导人肺泡样巨噬细胞的炎症，这依赖于受体FcαRI和激酶Syk。

促炎细胞因子产生主要由IgA2亚类诱导

人类表达两种不同的IgA亚类，IgA1和IgA2。先前的研究表明，重症COVID-19患者与轻度症状患者相比，表达更高水平的抗刺突蛋白IgA，特别是IgA2。与这些发现相似，我们的数据还揭示，重症（住院）COVID-19患者表现出IgA水平增加，与轻度（非住院）患者相比，抗刺突蛋白IgA2的增加更为明显。

为了确定巨噬细胞对IgA亚类是否有不同的敏感性，研究人员用具有相同Fab区域的单克隆抗刺突蛋白IgA1或IgA2刺激巨噬细胞，并测定促炎细胞因子的产生。虽然两种亚类在与Poly(I:C)共同刺激时均诱导巨噬细胞产生细胞因子，但IgA2驱动的细胞因子产生显著高于IgA1，适用于所有测量的细胞因子，包括IL-1β、IL-6、IFN-γ、TNF和IL-10。值得注意的是，虽然IgA2特别放大了促炎细胞因子，但它仅适度增加了抗炎IL-10的产生。对于两种亚类，炎症效应都依赖于FcαRI和Syk。有趣的是，IgA2诱导的促炎细胞因子产生似乎更依赖于FcαRI，因为TNF和IFN-γ的减少显著高于IgA1，IL-6和IL-1β也显示出相似的趋势。此外，IgA2依赖的IL-1β和IFN-γ产生在Syk抑制后显著减少，比IgA1依赖的细胞因子产生减少更多，TNF和IL-6也有可比趋势。

进一步研究Syk信号 cascade，研究人员应用了多种针对磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）亚单位的抑制剂，PI3K是Syk的直接靶标。研究发现，用alpelisib（PI3Kα抑制剂）、duvelisib（PI3K-γ/δ抑制剂）或idelalisib（PI3Kδ抑制剂）处理均导致IgA共同刺激的巨噬细胞中细胞因子TNF和IL-6水平降低，但在仅用Poly(I:C)刺激的巨噬细胞中没有影响。这表明IgA放大的炎症是通过FcαRI-Syk-PI3K轴介导的。

这些促炎细胞因子基因的mRNA表达被发现在大约3-6小时达到峰值。有趣的是，虽然IgA1和IgA2刺激在蛋白质产生方面导致显著差异，但在基因表达方面只有微小差异，IgA2刺激后促炎细胞因子mRNA水平仅略高。因此，对于所有测试的细胞因子，IgA2/IgA1刺激后的蛋白质产生比率高于IgA2/IgA1诱导的mRNA表达比率。这表明IgA亚类不同的促炎效应仅在基因转录水平上部分受到调控。

IgA2诱导的炎症更依赖于糖酵解并导致比IgA1更高的线粒体琥珀酸脱氢酶活性

虽然IgA诱导的炎症与细胞代谢变化有关，但尚不清楚两种IgA亚类是否诱导不同类型的代谢重编程。为了研究IgA亚类依赖性炎症的代谢依赖性，研究人员在用抗刺突蛋白IgA和Poly(I:C)刺激之前，将巨噬细胞与不同的代谢途径抑制剂一起孵育。总的来说，IgA介导的巨噬细胞细胞因子产生关键依赖于糖酵解、磷酸戊糖途径和脂肪酸合成，因为分别用2-DG、6-AN和C75抑制这些代谢过程会导致IL-6、IL-1β、IFN-γ和IL-10水平降低。用etomoxir抑制脂肪酸氧化不影响细胞因子产生。

有趣的是，当比较这些代谢抑制剂在IgA亚类之间的效果时，只有糖酵解抑制剂2-DG在完整的促炎细胞因子组中显示出显著差异。为了更详细地研究糖酵解和IgA亚类依赖性激活之间的关联，研究人员测量了巨噬细胞乳酸产量作为糖酵解能力的指标。在单独用抗刺突蛋白IgA刺激巨噬细胞时，只有IgA2触发乳酸产量的显著增加，而IgA1没有。与Poly(I:C)共同刺激导致用IgA2刺激时比用IgA1刺激时产生更高的乳酸产量。进一步研究潜在的下游机制，研究人员发现葡萄糖转运蛋白1（GLUT1），由SLC2A1编码，特别由IgA2共同刺激诱导。总之，这些数据表明糖酵解是观察到的IgA1和IgA2之间差异激活的主要代谢驱动因素之一。

除了糖酵解重编程，研究人员使用MTT assay评估了细胞的线粒体活性，该 assay 测量线粒体琥珀酸脱氢酶（SDH）活性。线粒体SDH活性主要受IgA2抗体同种型的影响，因为抗刺突蛋白IgA2刺激导致更高的线粒体MTT转化水平，突出了线粒体活性 alongside 糖酵解重编程对于IgA2特异性炎症的重要性。

IgA2增强巨噬细胞中的糖酵解并改变线粒体功能

鉴于观察到的乳酸产量和线粒体SDH活性的变化，研究人员使用Seahorse assays进一步检查了IgA诱导的代谢重编程。与我们的乳酸测量一致，Poly(I:C)刺激显著增加了糖酵解，如升高的质子流出率（PER）所示。与Poly(I:C)单独相比，用IgA2共同刺激进一步增强了巨噬细胞糖酵解通量，而IgA1没有附加效应。糖酵解参数分析显示，与单独由Poly(I:C)激活的巨噬细胞相比，IgA2共同刺激主要增强了基础糖酵解，而没有显著影响最大糖酵解能力或储备。相反，基础、最大和储备耗氧率（OCR）在刺激条件下统计上未受影响。然而，IgA1和IgA2刺激均诱导线粒体质子漏显著增加，表明线粒体完整性或效率改变。

为了进一步探索糖酵解和有氧呼吸之间的相互作用，研究人员跟踪了葡萄糖注射后的OCR变化。葡萄糖添加后OCR的减少表明能量偏好向糖酵解ATP生产的转变，这反映了对糖酵解能量生产的依赖性。IgA1和IgA2都增强了葡萄糖诱导的OCR下降，IgA2效应更强。此外，与单独用Poly(I:C)刺激的细胞相比，IgA2-Poly(I:C)共同刺激的巨噬细胞显示出更高的葡萄糖非依赖性OCR（定义为葡萄糖前OCR和抑制剂后OCR之间的差异）。整合PER和OCR数据，研究人员观察到Poly(I:C)刺激的巨噬细胞采用更依赖糖酵解的代谢特征，这被IgA2进一步放大。这种转变在基础能量表型中很明显。在代谢压力下，IgA2刺激的细胞表现出增强的糖酵解和有氧呼吸能力，如增加的最大PER和OCR值所示。这些结果突出了IgA2在炎症背景下增强巨噬细胞代谢适应性的能力。

IgA2依赖性炎症和不同巨噬细胞模型中的代谢变化

为了调查我们的发现在不同组织驻留巨噬细胞亚群中的适用性，研究人员使用GM-CSF生成了疾病相关巨噬细胞模型。IgA诱导的对细胞因子产生、线粒体SDH活性和乳酸产量的效应在不同的巨噬细胞亚群中是可重复的。这表明IgA亚类依赖性过度炎症和相关的代谢改变可以推广到其他巨噬细胞亚群。

讨论

重症COVID-19是一种以过度炎症为特征的免疫性疾病。虽然已知抗刺突蛋白IgG同种型抗体强烈促进这种炎症，但关于IgA（粘膜组织中的主要同种型）的作用仍知之甚少。使用不同的体外巨噬细胞模型，研究人员确定抗刺突蛋白IgA免疫复合物强烈促进这些巨噬细胞的炎症。这种效应 specifically 由IgA2亚类驱动，并依赖于代谢过程，特别是糖酵解。这些结果表明IgA2具有促炎作用，这可能进一步促进在重症COVID-19患者中观察到的过度炎症。

IgA大多被称为粘膜免疫球蛋白，负责在病原体相互作用的原发部位进行非炎症性免疫调节。然而，近年来，IgA在感染期间更具促炎功能的作用已被描述。IgA免疫复合物可通过FcαRI激活中性粒细胞和其他髓系免疫细胞，如巨噬细胞，导致促炎细胞因子产生。此外，IgA可促进各种疾病中的炎症，包括自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎和IgA大疱性疾病。在COVID-19中，抗刺突蛋白IgA滴度与重症患者中观察到的破坏性炎症过程相关，如CRP、中性粒细胞激活以及随后的器官损伤和致命结果。IgA反应的时间动态对于这种疾病进展很重要。血清抗刺突蛋白抗体的诱导通常在症状出现后1-2周发生，并在3-4周达到峰值。我们的数据显示IgA刺激放大了巨噬细胞的炎症，因此表明高滴度抗刺突蛋白IgA可能触发和/或延续过度炎症状态。

在重症COVID-19患者中，IgA2同种型在血清中显著富集。由于肺部炎症或急性呼吸窘迫综合征（ARDS）期间上皮通透性增加，允许（非分泌型）血清IgA进入肺泡空间，抗刺突蛋白IgA2水平在这些重症COVID-19患者的肺泡空间中可能也增加。研究人员发现，COVID-19相关的促炎细胞因子（如IL-6和TNF）的产生在用IgA2刺激时显著高于IgA1。有趣的是，对IL-10产生的亚类依赖性效应不太明显，表明IgA2特别诱导促炎细胞因子，但对抗炎IL-10影响较小。这些发现与先前表明IgA2是更具促炎性IgA亚类的研究一致。然而，这些来自体外巨噬细胞模型的发现需要在原代肺泡巨噬细胞中进行验证以扩展其生理相关性。

IgA2增强的炎症潜力已在存在于呼吸道中的各种髓系细胞亚群（例如，DC、中性粒细胞和巨噬细胞）中得到描述。然而，IgA1和IgA2之间的免疫激活特征的区别可能是组织特异性的。例如，在单核细胞中，IgA1可以触发比IgA2更有效的促炎反应。此外，虽然IgA2水平升高在COVID-19中有报道，但尚不清楚这是否是SARS-CoV-2特异性的，还是也发生在其他呼吸道病毒严重感染期间。需要进一步的研究来确定这是否是（严重）呼吸道病毒疾病的更广泛特征。

有趣的是，IgA1和IgA2诱导的炎症都高度依赖于FcαRI，已知FcαRI在来自BAL的肺泡巨噬细胞和其他组织驻留巨噬细胞上表达。IgA亚类炎症能力的差异可能与其不同的抗体结构有关，这可能表现出对FcαRI的不同结合亲和力。例如，IgA1较长的铰链区提供更大的灵活性和额外的糖基化位点，可能影响其受体结合亲和力。此外，已经描述了FcαRI的各种剪接变体，这可能有助于观察到的效应功能差异。选择性剪接可能导致具有不完整或缺失蛋白质结构域的异构体，这些结构域参与细胞外结合或信号传导。这些剪接变体对抗体亚类的亲和力以及可能随后的功能差异仍有待阐明。

IgA1和IgA2诱导的炎症都依赖于信号分子Syk。因此，观察到的差异可能是数量上的而非质量上的，反映了Syk信号传导水平的增加。理论上，这也可能表明存在一个也通过Syk信号传导的IgA2辅助受体。或者，可能存在一个用于IgA1的额外抑制性受体，从而减弱IgA1刺激后的炎症反应。除了FcαRI之外，还有少数已知的IgA受体，例如pIgR和Fcα/μR，可能在这方面发挥作用，并且将在未来的研究中值得研究。

在重症COVID-19患者中，抗刺突蛋白IgG表现出异常的Fc尾部糖基化，其特征在于低岩藻糖基化和高半乳糖基化，通过FcγRs强烈促进炎症。糖基化也可能在IgA诱导的炎症中发挥作用，因为与IgG相比，它通常糖基化程度更重。IgA亚类的糖基化谱彼此不同，IgA1表达高唾液酸和半乳糖的N-聚糖，而IgA2包含较不复杂的N-聚糖。此外，IgA1较长的铰链区有多个糖基化位点，表达高度唾液酸化的O-聚糖。其较短、未糖基化的铰链区稳定粘膜中的IgA2，也可能导致与存在于髓系免疫细胞上的聚糖受体的不同结合选项。此外，重症COVID-19患者的IgA糖基化谱有特定改变，IgA1 O-聚糖具有低唾液酸化和高半乳糖化，而IgA2在某些N-糖基化位点呈现更高的唾液酸化。这种疾病特异性的IgA亚类差异值得纳入未来研究，以增加对其在抗体诱导炎症中贡献的理解。

虽然研究人员在巨噬细胞炎症细胞因子蛋白质产生方面观察到显著的IgA亚类差异，但IgA1和IgA2在转录水平的差异有限，表明其他调控机制 underlie 不同的激活能力。免疫代谢改变在调节巨噬细胞表型中发挥重要作用，因为代谢过程 underlie 它们的促炎和抗炎能力。肺泡巨噬细胞在严重SARS-CoV-2感染期间也经历代谢重编程，因为过度激活的免疫反应和疾病进展与不同的葡萄糖代谢有关。先前，研究人员已经表明，由IgG免疫复合物触发的FcγR信号传导增强了巨噬细胞的糖酵解能力。在本研究中，研究人员发现IgA诱导的巨噬细胞炎症依赖于至少三个代谢途径：糖酵解、磷酸戊糖途径和脂肪酸合成。与细胞因子产生相似，高度糖酵解状态被TLR共同刺激进一步诱导。这一发现与FcαRI诱导的肠道CD103⁺ DCs中的糖酵解重编程一致，表明在气道和肠道中先天免疫细胞中存在相似的代谢过程。

由于IgG亚类先前已与巨噬细胞中的差异代谢重编程相关联，分析了不同的抗刺突蛋白IgA亚类对其代谢重编程能力。IgA2诱导的炎症似乎比IgA1更受糖酵解重编程支持，如2-DG处理后IL-6、TNF、IL-1β和IFN-γ的更大减少所示，但抗炎细胞因子IL-10没有减少，同时乳酸产量增加。这可能是更强炎症状态对能量依赖更高的结果，或者是由于IgA同种型介导的代谢重编程中的差异信号传导。值得注意的是，GLUT1（SLC2A1）转录受Syk控制，进一步强化了FcαRI-Syk轴和代谢相互作用在调节巨噬细胞免疫反应中的作用。没有共同刺激剂Poly(I:C)，乳酸生产仅由IgA2触发，进一步证明了亚类依赖性的代谢转变，并与我们的数据一致，表明IgA2刺激细胞的糖酵解活性增加。此外，我们的seahorse assay还揭示了IgA2增强的巨噬细胞糖酵解能力，进一步支持葡萄糖代谢参与IgA2依赖性炎症。葡萄糖注射后OCR的显著下降，特别是在IgA2刺激的巨噬细胞中，表明代谢向增加对糖酵解ATP生产的偏好和减少对氧化磷酸化的依赖转变，这是促炎巨噬细胞的一个标志。有趣的是，与单独用Poly(I:C)刺激的细胞相比，IgA2-Poly(I:C)共同刺激的巨噬细胞显示出更高的葡萄糖非依赖性OCR，表明这些巨噬细胞更依赖于葡萄糖以外的能源进行有氧呼吸。因此，这些代谢途径可能构成未来研究和治疗干预的有趣靶点。

除了糖酵解，线粒体功能的改变已被证明可以调节巨噬细胞的表型。我们的数据表明IgA促进巨噬细胞中线粒体SDH介导的MTT转化，特别是在用IgA2免疫复合物刺激时。这表明IgA2激活的巨噬细胞中SDH活性增加，与先前显示SDH对巨噬细胞炎症反应关键的研究一致。SDH活性通过TLR刺激后增加的IL-1β和减少的IL-1RA和IL-10与炎症相关。然而，研究人员发现没有Poly(I:C)的IgA2刺激已经导致更高的线粒体活性，表明特定抗体亚类免疫复合物在线粒体免疫调节中的潜在作用。靶向琥珀酸氧化可能是一种有前途的病毒感染治疗策略，例如，通过竞争性SDH抑制剂二甲基丙二酸酯（DMM），先前已描述其在体内有效抵消炎症。

总之，我们的数据表明抗刺突蛋白IgA2免疫复合物触发巨噬细胞中的炎症激活，特别是在重症COVID-19的背景下。伴随的代谢改变突出了IgA亚类在抗体诱导炎症期间巨噬细胞代谢重编程中的差异作用。这些发现可用于开发针对重症COVID-19和潜在其他IgA2相关疾病的治疗策略。