PI3Kδ活性缺失通过损害外周Treg分化驱动自身免疫性结肠炎的机制研究

本文揭示了PI3Kδ功能失活通过特异性损害结肠Helios?外周调节性T细胞（pTreg）分化，导致肠道免疫耐受破坏的核心机制。研究结合体内外实验证实，PI3Kδ缺失虽不影响Treg整体抑制功能，但显著削弱TGF-β介导的胸腺外Treg诱导能力，为PI3Kδ抑制剂临床应用中的肠道不良反应提供了关键理论依据。

　　

2.1 PI3Kδ^D910A小鼠发生结肠限制性炎症

研究采用系统性PI3Kδ失活的小鼠模型（PI3Kδ^D910A），发现其于17-22周龄出现结肠组织增厚、绒毛结构破坏等炎症表型。预炎症期（8-9周龄）小鼠虽无显著症状，但其结肠/盲肠引流淋巴结（C1淋巴结）已明显肿大。流式细胞分析显示，PI3Kδ^D910A小鼠小肠和结肠引流淋巴结中Treg比例降低，但胸腺中Foxp3⁺ CD4单阳性细胞增加，且CD25⁺ Foxp3^? Treg前体细胞（ precursor 1）比例升高。此外，PI3Kδ^D910A Treg表达CD38（高抑制能力标志物）降低，ICOS表达升高，PD-1表达显著下降，而 mesenteric淋巴结中Blimp-1（Treg表型稳定性相关转录因子）表达特异性减少。

16S rRNA测序显示，PI3Kδ^D910A小鼠粪便微生物组与野生型（WT）显著分离，其中 Muribaculaceae（S24-7科）丰度显著降低，提示肠道菌群紊乱可能参与炎症发生。

2.2 PI3Kδ^D910A Treg未表现普遍抑制功能缺陷

尽管Treg比例降低，PI3Kδ^D910A小鼠并未出现系统性自身免疫炎症，表明整体免疫稳态仍得以维持。研究发现PI3Kδ^D910A Treg的CTLA-4表达反而升高，且其通过 trogocytosis 从树突状细胞（JAWS细胞系）获取CD80/CD86-GFP的能力增强。体外抑制实验表明，在抗CD3/CD28 Dynabeads或树突状细胞（DC）提供TCR刺激的条件下，PI3Kδ^D910A Treg对常规T细胞（Tresp）增殖的抑制能力与WT Treg无显著差异。这些结果说明PI3Kδ失活并未导致Treg细胞内在抑制功能缺陷，提示结肠炎症的发生具有环境特异性。

2.3 结肠浸润免疫细胞表型分析揭示Helios^? Treg特异性缺失

通过质谱流式细胞术（CyTOF）对肠道组织（包括小肠和结肠上皮内及固有层免疫细胞）进行深度表型分析，发现PI3Kδ^D910A小鼠结肠固有层（cLP）Treg中Helios^?群体几乎完全缺失，而Helios⁺ Treg比例显著增加。激活标志物CD44和CD69表达未升高，排除近期TCR激活导致的Helios上调。此外，PI3Kδ^D910A cLP Treg高表达组织滞留标志物CD103和TNF受体家族成员OX40，而RORγt表达与WT无显著差异。流式细胞术进一步证实，PI3Kδ^D910A小鼠结肠中Helios^? RORγt⁺ Treg亚群缺失，同时Helios⁺ RORγt⁺ Treg及RORγt⁺ 常规T细胞（Th17）增多，表明炎症环境中效应T细胞积累。

2.4 体外诱导iTreg显示关键抑制标志物上调受损

通过TGF-β诱导的体外iTreg分化模型，发现PI3Kδ^D910A na?ve CD4⁺ T细胞的Foxp3诱导效率显著降低，且在不同TGF-β浓度下均表现一致。但若将抗体刺激替换为B细胞提供抗原呈递（APC刺激），则WT与PI3Kδ^D910A细胞的Foxp3诱导差异大幅缩小，提示APC提供的共刺激信号可部分补偿PI3Kδ缺失导致的TCR信号减弱。

转录组分析显示，PI3Kδ^D910A iTreg中 Foxp3、CD38、PD-1 表达持续偏低，而CD103（Itgae）表达升高。关键基因 Dusp4（促进Treg激活和组织滞留相关基因表达）和 CCR8（高抑制性组织浸润Treg标志物）在WT iTreg中快速上调，而在PI3Kδ^D910A细胞中无响应。蛋白组分析证实CCR8表达降低。值得注意的是，体内cLP Treg几乎全部为CCR8⁺，而PI3Kδ^D910A小鼠脾脏中CCR8⁺ Treg比例反而升高，提示tTreg可能试图补偿但无法有效定植肠道。

2.5 体内胸腺外Foxp3诱导在PI3Kδ活性缺失时受损

通过将 na?ve Foxp3^? CD4⁺ T细胞过继转移至RAG2^?/?宿主，并辅以WT Treg共转移以维持耐受环境，发现5周后PI3Kδ^D910A来源的 donor细胞在结肠中Foxp3⁺比例显著低于WT。这些实验性 pTreg 的Ki67和CCR8表达与WT无差异，但Helios表达普遍较低，说明Helios上调并非PI3Kδ失活的直接结果。该实验直接证实PI3Kδ功能缺失损害体内pTreg分化能力。

3 讨论

本研究阐明PI3Kδ在TGF-β介导的胸腺外Treg诱导中发挥关键作用，其缺失导致结肠Helios^? pTreg群体丢失及CCR8⁺ 组织滞留型Treg分化受损。这种缺陷具有微环境特异性，与肿瘤免疫治疗中PI3Kδ抑制剂引起的肠道不良反应（irAEs）高度相关。研究提出pTreg可能特异性识别某些共生微生物抗原并维持耐受，而PI3Kδ失活后该机制崩溃，导致炎症发生。未来研究需深入探索PI3Kδ信号与TCR、TGF-β通路交叉对话的分子机制，以及不同Treg亚群在肿瘤和肠道环境中的功能异质性。