马哮喘严重程度与中性粒细胞胆固醇含量及NET形成的相关性研究

本文深入探讨了马哮喘（EA）严重程度与中性粒细胞胆固醇含量及中性粒细胞胞外诱捕网（NET）形成之间的关联。研究发现，疾病严重性伴随局部NET调节因子（如DNase和eCATH1）的失调及循环抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCAs）升高，提示胆固醇稳态失衡和NET过度形成可能共同驱动疾病进展，为EA的诊断和治疗提供了新视角。

　　

ABSTRACT

马哮喘（EA）是马中最常见的慢性肺部疾病，中性粒细胞是严重EA的主要效应细胞。中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）在人类哮喘和慢性阻塞性肺疾病（COPD）中被认为是疾病严重程度的贡献因素。因此，本研究旨在探讨马中性粒细胞、血液和支气管肺泡灌洗液（BALF）中NET相关因子是否能够区分EA的严重程度，并揭示EA中NET相关的机制见解。

1 Introduction

马哮喘综合征是一种复杂的、慢性的、非感染性的马肺部炎症性疾病。临床症状如慢性咳嗽、呼吸困难和运动不耐受由气道高反应性、支气管收缩、黏液分泌增多和气道重塑引起。两个EA表型根据全球共识被区分：轻度-中度（mEA）和重度EA（sEA）。mEA的特征是肺部混合性、中性粒细胞性、肥大细胞性或较少见的嗜酸性粒细胞炎症。持续性气道中性粒细胞增多是sEA的标志，显示出与人类中性粒细胞性晚发哮喘和人类COPD的相似性。

NETs是中性粒细胞在炎症过程中释放的具有抗病原体特性的支架样结构，由DNA骨架和瓜氨酸化组蛋白组成，用于困住病原体并将其暴露于浓缩的抗菌元素，包括髓过氧化物酶（MPO）和抗菌肽（AMP），如马cathelicidins 1-3（eCATH1、eCATH2和eCATH3）。NETs在感染性和非感染性疾病以及自身免疫性疾病中均有描述，并可由多种刺激诱导。它们受到宿主DNases的严格调节。然而，根据多因素方面，它们可能具有有益和有害的双重效果，因此被称为“双刃剑”。

2 Results

2.1 NETs and DNase Activity, as NET Modulating Factor, Vary Depending on the Severity of EA in BALF

作为局部受限性疾病，EA中NETs的发生在BALF中随疾病严重程度增加。通过免疫荧光共聚焦显微镜结合核染色和NET特异性抗体，我们能够识别BALF中随疾病严重程度增加的NET激活细胞比例。健康马的中性粒细胞仅显示31.05%（±23.04）的NET激活核，而这一比例随疾病严重程度增加，在重度哮喘马中达到61.72%（±19.62）。此外，NET纤维在sEA病例中更常见。

在细胞游离BALF中，通过ELISA测量了三种选定的NET标志物：游离双链DNA（dsDNA）、MPO-组蛋白复合物和瓜氨酸化组蛋白3（citH3）。然而，没有一个NET标志物足以区分疾病严重程度，或与激活细胞的数量相关。细胞游离材料不是NETs的可靠标志物，因为细胞外DNA也可能来源于其他形式的细胞死亡，使得此类物质在细胞游离背景下 inherently 非特异性。

由于NETs受到宿主DNases的严格调节，BALF中的DNase活性可能影响了NET标志物的可检测性和研究马中慢性炎症的持续性。因此，通过荧光活性 assay 定量评估了DNase活性，揭示了在modEA马中活性升高，而在重度EA马中活性降低。

除了DNase活性，一个已知调节局部NET动态的有效宿主因子是抗菌肽eCATH1。类似于人类AMP LL-37，eCATH1可能作为中性粒细胞趋化因子，以及NET诱导剂和 against nuclease降解的稳定剂。在这里，我们的研究发现其浓度在sEA马中相较于健康对照升高。尽管BALF中的eCATH1没有显示显著增加，但与哮喘严重程度相关的趋势明显，与BALF中性粒细胞比例相关的sEA马出现明显聚集。

2.2 ANCAs in Serum Increase in sEA

基于BALF结果，我们假设严重患病动物中失调的局部NET形成会引发针对中性粒细胞衍生蛋白的自身免疫。在各种自身免疫性疾病中，ANCAs与NET形成的病理副作用和慢性炎症有关。肺部受累是ANCA相关性血管炎的临床特征。为了调查ANCAs的发生，我们进行了改良的 western blots，其中我们使用消化的NET蛋白作为抗原来检测血清中的循环NET自身抗体。观察到的条带大小和模式在个体动物和EA严重程度之间不同，表明研究动物中存在不同的ANCAs。有趣的是，重度哮喘马显示出比所有其他组更高的总条带强度；然而，健康马和sEA马之间的差异未达到显著性。

2.3 NET Formation by Peripheral Blood Neutrophils in Response to eCATH2 Increases with Disease Severity

由于循环ANCAs表明哮喘马全身免疫反应的变化，我们假设循环血液中性粒细胞的功能也会在这些动物中受到影响。为了研究这一点，我们使用密度梯度从研究马中分离新鲜外周血中性粒细胞，并量化了体外NET形成对eCATHs的反应。如上所述，eCATHs是马中天然存在的NET诱导剂，并且eCATH1在sEA的BALF中发现升高与BALF中性粒细胞增多相关。有趣的是，当比较来自不同哮喘组的循环中性粒细胞在体外用马cathelicidins刺激后的NET形成时，观察到差异。在sEA与健康马中，与eCATH2孵育后体外NET形成存在显著差异。

然而，在血清中，测量的NET标志物和分析的NET调节剂（DNase活性和eCATH1）在健康马或EA表型之间没有显著差异。此外，我们观察到组内相当大的个体间变异性。这些观察指出循环中性粒细胞的内在变化，导致我们更详细地检查NET形成能力与血液中性粒细胞细胞参数的相关性。

2.4 Cholesterol of Blood Neutrophils Decreases with Disease Severity and Correlates with NET Formation

考虑到细胞胆固醇对各种中性粒细胞功能（包括NET形成）的巨大影响，我们通过高效液相色谱（HPLC）分析了分离的外周血中性粒细胞的胆固醇浓度。甲基-β-环糊精（CD）被用作对照，其众所周知可以消耗胆固醇并诱导NETs。总细胞胆固醇在未刺激的中性粒细胞和CD处理的细胞中组间存在显著差异。CD有效地从所有马的中性粒细胞中消耗了胆固醇，如先前在人类中性粒细胞中所示。重要的是，从健康马分离的中性粒细胞表现出显著更高的总细胞胆固醇含量，与中度（p = 0.0016）和sEA（p ≤ 0.0001）相比。在轻度EA中观察到类似趋势，尽管不显著（p = 0.437）。

由于用于体外NET形成分析的中性粒细胞和总细胞胆固醇测量来自同一匹马和相应的中性粒细胞分离过程，我们能够将细胞胆固醇数据与NET形成相关联。观察到细胞胆固醇浓度与NET形成之间存在显著负相关，证实了中性粒细胞胆固醇含量影响研究马中的NET形成。膜稳定性受到较低胆固醇的影响，导致更容易刺激和NET形成。

基于这种相关性，我们假设全身胆固醇稳态、NET形成和马哮喘之间存在联系。为了进一步探索这一点，我们量化了血浆中的胆固醇参数，以深入了解胆固醇调节，并评估它们作为EA易测量生物标志物的潜力。血浆总胆固醇浓度随疾病严重程度降低，在健康和sEA之间差异显著。再次，在亚临床马中也观察到趋势。LDL胆固醇在中度和sEA中降低，尽管存在大的个体间变异。总细胞胆固醇与总血浆胆固醇显著相关，表明存在影响胆固醇稳态的全身和细胞机制。为了排除肝脏疾病，我们分析了所有马中肝脏相关酶。没有临床相关升高超过参考范围，也没有组内肝脏酶与细胞胆固醇含量之间的相关性。

2.5 Cholesterol Homeostasis and Hypoxia Are Connecting Local and Systemic Inflammatory Parameters

慢性缺氧是EA的一个已知特征，并与疾病严重程度和进展相关。除了其临床相关性，缺氧还在细胞过程中发挥调节作用，包括胆固醇稳态——通过影响胆固醇生物合成、摄取和运输途径。鉴于缺氧对免疫功能和脂质调节的双重影响，我们旨在研究缺氧是否与EA中观察到的关键局部（例如，BALF中性粒细胞中的NET形成）和全身（例如，中性粒细胞胆固醇含量、血浆胆固醇、循环NET标志物和ANCAs）变化相关。为此，我们使用两个既定的临床参数——动脉氧分压（PaO₂）和肺泡-动脉氧梯度（AaDO₂）——作为研究马中缺氧状态的指标。

确实，Spearman相关分析揭示了几个变量之间的中度到强相关性：发现缺氧与中性粒细胞细胞胆固醇以及分离血液中性粒细胞的NET形成之间存在显著相关性。额外的相关性将BALF中的NET丰度与中性粒细胞胆固醇浓度和全身胆固醇稳态标志物联系起来。此外，气道中性粒细胞增多显示出与细胞和全身胆固醇修饰的强关联。这些发现突出缺氧作为一个潜在的上游调节剂，将代谢失调与中性粒细胞激活和NET形成联系起来，表明在马哮喘中慢性气道炎症（AI）的一个整合机制。

3 Discussion

用于EA亚临床阶段和进展的可靠生物标志物仍然缺乏，并且潜在的疾病机制仍然 only partially understood。EA是马中临床相关且广泛存在的呼吸系统疾病，与人类哮喘和COPD共享关键病理和临床特征。我们的发现为EA的发病机制提供了新的见解。

本研究的一个关键发现是严重哮喘马中激活的中性粒细胞和NET形成的增加，突出了NETs可能通过其贡献局部AI的机制。考虑到这一点，我们进一步检查了已知调节NET形成和持久性的因素，包括BALF中的抗菌肽eCATH1和DNase活性。两个参数都显示出与疾病严重程度相关的修饰，表明NET产生和清除之间的不平衡可能在sEA中维持AI发挥作用。

尽管BALF中的eCATH1浓度没有显示显著的总体增加，但其与BALF中性粒细胞比例的相关性揭示了sEA马的明显聚集。有趣的是，先前的研究表明中性粒细胞本身在马中不释放eCATH1，使得哮喘肺中eCATH1表达的细胞来源和调节机制 unclear。可以假设，尚未识别的因素驱动eCATH1以严重程度依赖的方式释放到气道中。在我们的研究中，eCATH1-3能够体外诱导所有检查马的循环中性粒细胞中的NET形成。因此，浸润肺部的