综述：从组织学到高分辨率图谱：空间组学在免疫学中的崛起

本综述系统阐述了空间组学（Spatial Omics）技术如何革新免疫学研究，重点介绍了空间转录组学（ST）、蛋白质组学、代谢组学/脂质组学及磷酸化蛋白质组学等前沿技术，及其在揭示肠道、肝脏和次级淋巴器官等复杂组织中免疫细胞的空间分布、微环境调控和功能特异性方面的突破性应用。

　　

1 引言

免疫系统的功能深受其解剖背景的影响，空间组织已成为免疫调控的基本法则。近年来，空间组学技术的飞速发展——涵盖转录组学、蛋白质组学、代谢组学、脂质组学和磷酸化蛋白质组学——彻底改变了我们在完整组织环境中研究免疫过程的能力。这些技术通过保留空间坐标的同时捕获高维分子数据，为我们理解免疫细胞状态和功能如何受局部信号和组织结构调控提供了前所未有的视角。

1.1 空间组学概述

空间组学是一类将分子分析与空间分辨成像相结合的技术，能够在原生组织架构中研究生物系统。与传统单细胞或批量组学方法（需解离组织从而破坏空间背景）不同，空间组学力求在捕获基因表达、蛋白质丰度、代谢物分布和翻译后修饰等高维数据的同时，保留解剖结构。这种空间信息层对于理解细胞状态如何受局部微环境、解剖梯度（尤其是在免疫器官或肝脏等复杂组织中）调控至关重要。

根据所分析的分子层，空间组学技术在分辨率、通量、覆盖范围和方法学上差异很大。本综述将方法学概述分为四大领域：转录组学、蛋白质组学、代谢组学/脂质组学和翻译后修饰。每个领域内都已出现不同的技术策略。

空间转录组学（ST）包括测序法和成像法。测序法平台依赖带有空间条形码的捕获探针，将RNA分子与其组织坐标关联，再进行下一代测序。这些方法提供广泛的转录组覆盖，但通常限于单细胞分辨率。相比之下，基于成像的平台，如组合杂交策略，可以直接在原位可视化数百至数千种RNA物种，达到亚细胞分辨率，但转录组广度受限。

空间蛋白质组学同样可分为基于抗体的方法和无标记方法。基于抗体的方法使用带条形码的抗体组或稀有金属同位素偶联抗体的检测，以单细胞分辨率定位数十种蛋白质，实现免疫细胞类型和相互作用的定量图谱绘制。或者，基于激光显微切割和质谱的无标记工作流程，可在定义的组织区域内提供无偏见的蛋白质组规模覆盖，尽管空间分辨率和通量较低。

空间代谢组学和脂质组学主要依赖质谱成像（MSI）技术。这些方法无需标记即可直接从冷冻切片组织中检测小分子，但受电离效率和分析物挥发性的限制。尽管如此，近期在低温MSI和多模态整合方面的进展极大地提高了分辨率和化学覆盖度，允许对代谢分区和脂质重塑进行详细绘图。

最后，需要考虑许多蛋白质的功能并非主要由其mRNA或蛋白质丰度调控，而是通过翻译后修饰（PTMs）控制的信号机制。然而，在所有分子调控层中，PTM的空间分析仍是空间生物学中最具技术挑战性的前沿领域之一。这在蛋白质磷酸化中尤为明显，其磷酸化肽段的低丰度和瞬时性需要富集方案和高样本投入，极大增加了工作流程和数据分析的复杂性。尽管如此，新方法正开始解析完整组织内的信号梯度，甚至在解剖学定义的血管床中也是如此。

1.2 空间转录组学

空间转录组学（ST）已成为一种突破性的测序技术，可在保留空间背景的情况下绘制组织切片内的基因表达图谱。最早于2016年引入，早期的ST方法依赖于打印在玻片上的固定阵列中的条形码捕获引物，其具有100 μm的大点，能够从多个细胞捕获RNA。虽然这些方法提供了广泛的转录组覆盖和高通量，但其相对较低的空间分辨率限制了单细胞水平的精度。为解决这一限制，开发了Slide-seq和高清空间转录组学（HDST）等新方法。Slide-seq使用涂有空间条形码寡核苷酸的珠子，随机分布在玻片上形成致密层，达到10 μm的分辨率——接近单细胞尺寸。HDST则通过在使用2 μm孔的磁珠阵列进一步推进，具有更高的图像分辨率。然而，这些高分辨率方法通常涉及较低的RNA捕获效率、复杂的工作流程和更高的测序成本。

Visium代表了ST领域的重大进步，它在保持用户友好工作流程的同时，提供了改进的灵敏度和通量。其具有55 μm的点，在空间分辨率和RNA捕获效率之间取得了平衡，每个捕获区域最多可达5000个空间点。该平台整合了组织学成像，以将基因表达数据与组织结构对齐，并通过多组学检测支持RNA和蛋白质检测。像Visium CytAssist和Visium HD空间基因表达检测这样的工具进一步扩展了样本兼容性并提高了分辨率。与Slide-seq和HDST相比，Visium提供了一个简化、商业化的平台，具有多功能性和可及性，在癌症、神经科学和发育生物学等领域有广泛应用。然而，Visium和Slide-seq的持续创新仍在解决分辨率、效率和可扩展性方面的挑战，巩固了ST作为一个快速发展的领域，对单细胞生物学具有变革性意义。

尽管取得了显著进展，Slide-seq和Visium仍局限于在薄组织切片中捕获基因表达，仅提供二维视图，而复杂的三维（3D）组织结构在很大程度上仍未探索。为克服其中一些限制，开发了一种用于分析空间定义的3D组织生态位转录组的先驱测序方案，命名为NICHE-seq。该技术结合了光激活荧光标记、双光子激光激发和单细胞RNA测序（scRNA-seq），以卓越的空间精度和单细胞分辨率绘制特定组织区域的分子和细胞组成。使用普遍表达光激活GFP的转基因小鼠，可以通过双光子激光激发选择性地光转换视觉定义的微环境（如体内标记的淋巴结和脾脏中的免疫生态位）中的细胞，以解除GFP荧光。随后将光转换的器官处理成单细胞悬液，并对光转换的GFP⁺细胞进行分选以进行scRNA-seq。这种方法保留了单细胞分辨率和细胞的空间起源，能够识别稀有的、生态位特异的免疫亚群及其相应的具有全转录组覆盖的基因表达谱。通过弥合空间背景和转录数据之间的差距，NICHE-seq为理解细胞3D空间组织如何控制免疫功能和病理学提供了一个强大的框架。然而，NICHE-seq有几个局限性。包括在肝脏等某些器官中光转换效率降低，目前仅适用于表达PA-GFP的转基因小鼠模型，以及在靶向小型组织生态位（100–200 mm³）时获得的细胞产量低。该技术还需要先进的双光子成像专业知识来实现快速精确的光转换，这对于保持RNA完整性至关重要。另一个限制是，由于迄今为止仅验证了一种光激活荧光团（PA-GFP），NICHE-seq目前每个器官每次只能光转换一种生态位类型，限制了多重空间采样。未来的发展应旨在实现人类组织中的光转换（可能通过使用光转换染料），并改进方案以最大限度地回收光转换细胞。同时，开发具有不同光谱特性的新型光激活蛋白质，将开辟在同一器官内同时标记多种生态位类型的可能性，极大地扩展该方法的空间分辨率和通量。

与测序法并行，基于成像的ST方法也被开发出来，以实现不依赖测序的亚细胞分辨率分析。一个主要例子是MERFISH（多重错误稳健荧光原位杂交，Vizgen的MERSCOPE平台），它允许在薄组织切片内直接可视化RNA分子，而无需测序。源自单分子FISH（smFISH），MERFISH通过采用组合条形码和顺序成像循环来增强原始方法，允许同时检测多个RNA靶标。简而言之，每个转录本被分配一个独特的二进制条形码——一种1和0的模式，通过多个成像轮次进行解码，以在纳米级分辨率下精确识别RNA分子。MERFISH的错误稳健条形码系统通过纠正读出错误确保高准确性，在复杂组织结构中可靠地映射转录本。虽然这种方法在空间精度方面表现出色，并能揭示RNA的亚细胞定位，但它在转录组覆盖范围上仍然有限，因为单次实验最多只能检测约1000个转录本。

其他基于成像的平台，如Xenium（10x Genomics）和CosMx（NanoString），大幅扩展了这种覆盖范围。确实，Xenium可以在约1 × 2.5 cm的捕获区域内分析多达～5000个转录本，而CosMx提供可比的高重通量能力和亚细胞分辨率。两个平台都保持高灵敏度，能够比MERFISH进行更广泛的转录组探查，同时保留精细的空间细节。在Satija小组最近的一项基准测试研究中，MERFISH在平衡灵敏度与特异性方面表现优于Xenium，在匹配的灵敏度水平下产生较低的非特异性荧光点检测背景噪声。然而，对于优先考虑转录组广度和更大捕获区域的研究，Xenium和CosMx相比MERFISH具有明显优势，使它们特别适用于复杂组织的全面空间图谱绘制。

1.3 空间蛋白质组学

与转录组学相比，蛋白质组学本质上受所需材料量的限制，并且覆盖范围较低。尽管如此，空间蛋白质组学通过实现蛋白质丰度和定位的原位绘图，捕获转录后调控和功能活跃的蛋白质状态，提供了强大的补充。

样品制备、质谱灵敏度和组织成像方面的最新进展使得能够开发出工作流程，以接近单细胞水平的分辨率分析数千种蛋白质。这种进展的一个近期例子是将高分辨率免疫荧光成像与激光显微切割和多重质谱分析相结合，允许跨定义的组织坐标进行定量蛋白质组重建。在这种方法中，对冷冻切片进行解剖标记物染色并高分辨率成像，以实现单个细胞及其空间分配的分割。然后使用激光捕获显微切割从特定微解剖区域分离细胞或小群细胞，保留原生结构。针对低输入材料优化蛋白质提取、消化和同重标签（例如TMTpro），并使用与离子淌度分离（例如FAIMS）耦合的高分辨率LC-MS/MS平台分析样品。这些改进以最少的材料输入产生高蛋白质组覆盖度，并允许生成肝脏分区的空间分辨蛋白质组图谱。通过重建肝细胞沿门静脉-中央轴的空间蛋白质组，该研究发现了代谢和结构蛋白的协调梯度，揭示了转录组学单独无法预测的意外分区程序。该方法使空间蛋白质组学能够超越基于抗体的成像方法，提供更深入的分子覆盖和无偏见的蛋白质发现。

尽管无标记蛋白质组学取得了进展，但对于全面和无偏见的蛋白质分析，低丰度靶标的检测和亚细胞定位仍然具有挑战性。在此背景下，基于抗体的空间蛋白质组学提供了以更高灵敏度和空间分辨率检测特定分子的能力。最近的进展现在允许在同一样本中共定位数百种蛋白质靶标，有效地将经典免疫荧光扩展为高维蛋白质组平台。这些方法代表了基于质谱的工作流程的宝贵补充。

CODEX（通过索引共检测，Akoya Biosciences的PhenoCycler平台）是一个为高分辨率空间蛋白质组学设计的多重成像平台，能够在保留空间背景的同时在完整组织切片内检测多达100种蛋白质标记物。传统的共聚焦和落射荧光显微镜通常由于光谱重叠而限于检测4-8种标记物，但CODEX通过使用寡核苷酸条形码抗体以及染色、成像和染料去除的迭代循环，在很大程度上克服了这一限制。这种方法提供了单细胞分辨率的蛋白质表达图谱，揭示了不同的免疫细胞如何在组织内分布和相互作用。通过保留组织结构，CODEX允许在特定空间生态位内进行蛋白质表达的定量分析，揭示疾病进展过程中的动态变化并发现罕见的免疫细胞亚群。然而，迭代成像过程可能耗时，并且需要小心处理以防止多个循环中样品降解。此外，与可提供全基因组数据的转录组方法不同，CODEX受限于可用抗体靶向的蛋白质。尽管有这些限制，该平台在整个组织切片上以高空间分辨率分析数十种蛋白质标记物的能力，已使其成为空间生物学中不可或缺的工具，提供了弥合分子分析与功能组织分析之间差距的见解。

还开发了其他基于抗体的蛋白质组学方法。例如，COMET（来自Lunaphore的一种空间蛋白质组学方法）使用基于微流体的顺序免疫荧光（seqIF）与现成的未偶联抗体，与CODEX相比更容易定制，并可跨标准玻片扩展。它支持在完全自动化的工作流程中高达40重的panel，提供具有可重复染色和保留组织完整性的高通量。与CODEX不同，COMET避免了需要定制偶联，降低了成本和发展时间。然而，与其他循环方法一样，总成像时间仍然显著，并且可以并行分析的标记物数量低于CODEX。

另一个领先的基于抗体的空间蛋白质组学平台MACSima（Miltenyi Biotec），通过MICS（MACSima成像循环染色）操作，提供了更深的多重能力——据报道在单个组织样本上可达～300种蛋白质标记物——同时保留组织形态和亚细胞分辨率。它具有一个交钥匙工作流程，包括经过验证的抗体库（>600种靶标）、完全自动化的染色和染料擦除循环，以及通过MACS iQ View软件进行集成分析。MACSima的优势在于其超高标记物通量和适用于发现应用。该平台还支持同切片多组学，将蛋白质分析与RNAsky探针结合，在数百种蛋白质标记物旁边捕获数十种RNA靶标。然而，增加的循环数可能会增加成像时间，并在数百轮中增加样品光漂白的风险。

1.4 空间脂质组学和代谢组学

虽然ST和蛋白质组学显著增进了我们对原位细胞行为的理解，但脂质和代谢物的空间绘图却滞后，主要是由于技术限制。与RNA和蛋白质不同，代谢物和脂质体积小、化学多样性高且流动性强。它们的挥发性和易降解性使样品制备和成像复杂化，难以在完整组织内保存和绘制其空间分布。

最近的进展正开始弥合这一差距。Tian等人描述了一种低温多模态质谱成像（MSI）流程，能够在冷冻保存的人和鼠肝脏切片中以亚细胞分辨率同时检测代谢物、脂质和蛋白质。该工作流程整合了解吸电喷雾电离（DESI）、气体簇离子束SIMS（GCIB-SIMS）和C₆₀-SIMS。DESI提供更广泛的组织图谱（～40 μm分辨率），而GCIB-SIMS在冷冻水合切片中达到～3 μm分辨率，C₆₀-SIMS检测金属偶联抗体用于蛋白质组叠加。通过避免化学固定或基质应用，该方法保留了超过200种代谢物和脂质的原生分布，并通过将低分辨率DESI图谱与高分辨率SIMS数据对齐来重建空间连贯性。该工作流程的核心创新之一是使用冷冻水合组织切片，无需化学固定或基质应用。这保持了易变代谢物和脂质的原生空间分布，同时保留了组织完整性。为了实现空间重建，使用低分辨率DESI-MS图谱来注册跨解剖区域的高分辨率SIMS数据，从而可以详细可视化整个肝小叶的分区代谢状态。

除此之外，像用于增强电离的基质辅助激光解吸电离（MALDI）-2和分子概率映射框架等创新提高了空间代谢组数据集的分辨率、灵敏度和可解释性。 together，这些方法实现了与ST和蛋白质组数据的整合，为局部代谢微环境如何影响肝脏稳态和疾病中的免疫调节提供了前所未有的见解。

1.5 空间磷酸化蛋白质组学

在空间组学技术中，磷酸化蛋白质组学仍然是技术需求最高的之一。磷酸化肽段的瞬时性和低丰度需要大量的样品输入和优化的富集策略。因此，磷酸化蛋白质组分析仍远未达到单细胞分辨率，目前仅限于批量或区域合并的样品。与转录组学和基于抗体的蛋白质组学方法相比，空间分辨的磷酸位点分析仍处于探索阶段，受限于材料需求和分析灵敏度。

最近，对肝脏内皮细胞进行了空间FACS分选，以生成第一个血管床的无标记磷酸化蛋白质组图谱。具体来说，利用具有明确空间表达的表面标记来从肝小叶的四个同心层分离和汇集内皮细胞：门静脉周围、门静脉周围、中央周围和中央。该策略能够收集足够的材料进行比较转录组学、蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析，同时保留空间信息。对于磷酸化蛋白质组学，使用二氧化钛（TiO₂）富集磷酸肽，并通过高分辨率质谱进行分析，在5132种蛋白质中产生了22,626个磷酸位点的综合图谱。尽管这需要大量的输入材料，但该方法揭示了跨肝小叶的磷酸位点丰度的稳健空间梯度，为位置依赖性信号动态提供了新的见解。

更近期的进展由nanoPhos策略代表。该平台通过结合多项旨在从最少材料中最大化灵敏度的创新，使磷酸化蛋白质组学适应冷冻切片组织。将组织切片冷冻保存并显微切割成定义的圆形区域——无需固定或染色。使用离液缓冲液在变性条件下提取蛋白质，随后进行微量胰蛋白酶消化和使用Ti??固定金属亲和色谱（IMAC）进行磷酸肽富集。然后使用针对低输入优化的超灵敏LC-MS/MS分析富集的样品。在测试应用中，包括小鼠肝脏，该方法从空间定义的组织区域产生了可重复的磷酸位点谱，尽管每个点检测到的磷酸位点数量与批量分析相比仍然相对较低。尽管如此，nanoPhos证明可以在没有事先解离或标记的情况下，以细胞分辨率解析组织固有的信号梯度。

总之，这些研究突出了空间磷酸化蛋白质组学当前的局限性和新兴能力，强调了其阐明细胞内信号如何受解剖和微环境背景塑造的潜力。

1.6 空间组学的最新进展

1.6.1 从绘图到机制：空间组学与免疫组织的逻辑

空间组学技术通过提供对细胞行为如何在组织物理轮廓内编排的空前分辨率，正在改变免疫学。这些工具不仅超越了静态图谱，现在正在揭示动态调控原则——局部信号如何驱动免疫适应，生态位如何形成和崩溃，以及这些过程在疾病中如何被扰乱。在本节中，我们考察空间组学如何阐明嵌入三个不同器官中的免疫逻辑：肠道、次级淋巴器官（SLOs）和肝脏。我们特意关注这些器官，因为每个都作为一个独特的模型系统，其中空间背景支配免疫功能，并且空间组学技术揭示了免疫调控的新维度。此外，这些是我们已发展出大量专业知识的组织，使我们能够批判性地解释最近的发现及其更广泛的意义。虽然并非详尽无遗，但这里强调的例子应被视为快速发展和广泛文献中的代表性快照。

1.6.2 肠道中的空间分辨免疫：从稳态结构到炎症重连

肠道不是一个均质的管道，而是由节段解剖、微生物梯度和上皮多样性塑造的微环境拼凑而成。为了适应这些变化的条件，不同的肠道区域进化出了专门的防御机制，确保整个肠道的最佳保护和稳态。因此，空间组学能够对这一景观进行前所未有的观察，揭示免疫监视如何根据区域特定需求进行调整，这并不令人惊讶。例如，通过利用Visium和CODEX，Harnik等人最近构建了人类近端小肠的空间分辨表达图谱，揭示了沿隐窝-绒毛轴的基因表达和免疫细胞分布的显著分区。他们的发现揭示了人类绒毛尖端肠细胞先前未被认识的免疫原性作用，它们主动招募γδ T细胞和巨噬细胞——挑战了先前基于小鼠模型的假设。相比之下，CD4⁺ T细胞和常规树突状细胞（cDCs）在绒毛底部富集。这种空间上截然不同的组织突出了物种特异性的肠道适应，可能影响宿主防御和炎症。补充这项工作，Hickey等人使用Visium、CODEX和单核转录组学的组合，生成了人类肠道的综合单细胞分辨率图谱，揭示了跨不同肠段的独特免疫微环境。他们的研究确定了小肠中富含适应性免疫的隐窝生态位，结肠中富含浆细胞的区域，以及与代谢调控和潜在疾病易感性相关的区域特异性巨噬细胞群。总之，这些研究揭示了基因调控程序如何在肠道内协调上皮分化和免疫监视，为理解克罗恩病和乳糜泻等病症的免疫学基础提供了有用的图谱。

除了提供细胞组织的静态图谱外，NICHE-seq和MERFISH等空间组学技术已开始揭示塑造稳态和疾病进程的动态免疫相互作用。例如，使用NICHE-seq，最近一项关于肠道免疫调控的研究揭示了不同的生态位如何协调调节性T细胞（Treg）功能以响应诸如肝螺杆菌之类的共生病原体。虽然Treg在肠系膜淋巴结中被诱导，但它们的免疫抑制功能在固有层（LP）达到顶峰，在那里CD206⁺巨噬细胞通过CCR2–CCL8信号与它们相互作用以维持耐受性。在结肠炎期间，这种空间区室化崩溃，导致促炎树突状细胞浸润和耐受机制破坏，为炎症性肠病（IBD）发病机制提供了新的见解。

沿着同样的思路，最近一项应用MERFISH-based分析结肠炎进展的研究，确定了响应组织损伤而出现的特殊炎症相关成纤维细胞群，形成炎症生态位，重塑肠道微环境。通过绘制成纤维细胞驱动的免疫反应的时间演变，该研究揭示了细胞相互作用如何驱动疾病缓解或进展，为IBD中的靶向治疗提供了新框架。

1.7 就地编程命运：次级和三级淋巴结构中的生态位印记

理解感染期间次级淋巴器官中的免疫调控对于开发新的疫苗和治疗策略至关重要。空间组学重塑了我们对次级淋巴器官中免疫分化的理解，揭示了微解剖背景以以前对批量或单细胞方法不可见的方式印记T细胞命运。例如，使用NICHE-seq结合双光子活体成像，我们小组最近证明，引流淋巴结内I型干扰素（IFN）信号传导的时间和位置决定了抗病毒CD4⁺ T细胞的极化。抗原特异性T细胞启动生态位中的早期IFN暴露触发了树突状细胞产生IL-6，促进滤泡辅助T细胞（T_FH）分化和体液免疫。相反，延迟或缺失的IFN信号传导有利于1型辅助T细胞（T_H1）分化，支持细胞免疫。IFN信号传导的这种时空分叉体现了细胞因子时空多效性的更广泛原则：即单一细胞因子根据其遇到的时间和地点可以发挥不同效应的概念。因此，空间组学不仅能够绘制免疫细胞分布图，还能解码控制免疫命运决策的背景逻辑——这一见解对疫苗设计和免疫治疗具有直接意义。

超越经典的次级淋巴器官，空间组学已开始阐明三级淋巴结构（TLSs）的结构、功能和治疗相关性——这些异位免疫聚集体出现在慢性炎症和癌症中。例如，在鼻咽癌中，Liu等人结合单细胞和Visium揭示了肿瘤微环境中TLSs的细胞结构和动态。他们的工作显示，成熟的TLSs含有CXCL13⁺癌症相关成纤维细胞、T_FH和B细胞，以及干细胞样CXCL13⁺CD8⁺ T细胞。这些有组织的免疫生态位支持生发中心反应，产生抗体分泌浆细胞，并促进EBV驱动的肿瘤细胞凋亡。TLSs与肿瘤聚集体的空间接近性与PD-1阻断的良好反应相关，并且TLS相关基因特征预测了预后和免疫治疗疗效。补充这一点，Tang等人使用ST剖析肝细胞癌中的TLS异质性，并确定了两种不同的不成熟TLS状态：顺应性和偏离性。虽然顺应性TLSs类似于成熟TLSs并支持抗肿瘤免疫，但偏离性TLSs与功能失调的免疫反应和免疫治疗耐药相关。他们的分析指出肿瘤驱动的色氨酸代谢是TLS偏离的关键决定因素。值得注意的是，色氨酸分解代谢的药理学抑制促进了TLS成熟，并与抗PD-1治疗协同增强肿瘤控制。这些发现强调了肿瘤微环境中的代谢线索如何影响TLS命运，并突出了促进TLS成熟作为提高免疫治疗疗效策略的治疗潜力。

总之，这些研究表明空间组学技术如何揭示淋巴结构形成的背景逻辑、所涉及的细胞参与者，以及在经典和异位生态位中有效免疫激活的代谢和分子障碍。它们还强调TLSs作为可操作的免疫枢纽，具有被利用或重编程以获得治疗益处的潜力。

1.8 肝脏中的代谢和免疫分区

肝脏是功能复杂性的奇迹，其中肝细胞、内皮细胞和非实质免疫群体沿门静脉-中央轴分布，形成具有独特代谢、信号和免疫学特征的同心微环境。其复杂的小叶结构——以氧气、营养物质、激素和信号分子的梯度为特征——揭示了代谢分区、细胞可塑性和免疫调控的基本原理。

空间组学技术的出现极大地扩展了这一框架。早期的单细胞研究通过显示肝细胞根据其沿小叶的位置显示不同的基因表达程序，重新定义了肝脏分区的概念。这种代谢分区不是随机的，而是遵循精确的解剖梯度，门静脉周围肝细胞富含糖异生和尿素循环酶，而中央周围肝细胞专门从事糖酵解、外源物代谢和脂肪生成。随后的研究显示，肝细胞分区不是细胞自主的，而是由周围微环境产生的空间组织信号主动塑造的。特别是，肝窦内皮细胞（LSECs）已成为肝脏模式形成的关键调节者。沿着窦状隙轴战略定位的LSECs产生梯度水平的Wnt配体、血管分泌信号和其他形态发生素，以区域特异性方式印记肝细胞身份，协调代谢功能与血管结构。

基于这些见解，空间分辨的多组学分析加深了我们对沿门静脉-中央轴的内皮细胞特化的理解。这种方法揭示了内皮亚群的离散分子身份，揭示了血管分区超越转录程序，包括空间模式的蛋白质表达和磷酸信号。 among the key findings，酪氨酸磷酸化 emerged as a central spatially regulated signaling event in the murine liver， enriched in pericentral endothelial cells， precisely where Wnt ligands are also concentrated。这表明局部血管磷酸化可能作为区域特异性线索的传感器或放大器，直接将内皮位置身份与肝细胞功能的调控联系起来。这些结果将肝内皮定位不仅仅是一个被动管道，而是一个指导性区室，整合空间信号以组织组织功能。

除了其代谢功能外，肝脏还拥有一个高度组织化的免疫系统，其由其解剖和血管结构塑造。免疫细胞不是随机分布的，而是沿门静脉-中央轴显示清晰的分区模式。库普弗细胞在门静脉周围区域富集，在那里它们拦截肠道来源的抗原，并通过抗炎细胞因子如IL-10和TGF-β促进耐受。相比之下，先天淋巴样细胞、NKT细胞和树突状细胞在中小叶和中央周围区域更丰富，在那里它们响应代谢应激和组织损伤。这些见解强调了肝脏如何整合位置线索以在其复杂微环境中协调免疫监视和耐受。

在此背景下，空间多组学的出现，提供了在单细胞分辨率下结合分子生物学和形态学信息的可能性，正在将解剖学和组织学的经典概念推向分子尺度。

一个突出的例子是深度视觉蛋白质组学（DVP）的应用，这是一种结合高分辨率成像、激光显微切割和基于质谱的蛋白质组学的技术，最近被用于生成小鼠肝脏的空间蛋白质组图谱。这种方法能够以前所未有的深度描绘肝细胞分区， uncovering hundreds of differentially expressed proteins distributed along the porto-central axis。这些包括参与氨基酸分解代谢、解毒和脂质代谢的众所周知的代谢酶，还有其分区分布先前未被认识的调控蛋白和转运蛋白。重要的是，DVP的无标记性质允许在没有抗体或遗传报告基因的情况下进行无偏见覆盖，捕获了肝细胞在其原生微环境中的蛋白质组景观。这项工作突出了空间蛋白质组学在补充转录组分析和解析复杂组织（如肝脏）内转录后调控方面的力量。

平行的努力应用空间代谢组学和脂质组学来进一步剖析肝小叶的功能结构。最近的一项多模态研究将MALDI成像与其他基于MSI的模式相结合，以绘制小鼠和人类肝脏中脂质和小代谢物的分布。这种空间代谢组分析揭示了关键脂质物种的惊人分区，包括磷脂酰胆碱、胆汁酸和甘油三酯，许多在门静脉周围和中央周围区域之间显示出尖锐的边界。此外，通过将代谢物分布与组织学和分子标记相关联，该研究证明了