雄激素受体调控BRCA1表达影响前列腺癌抗氧化防御机制的研究

本文揭示了雄激素受体（AR）信号通路通过转录抑制BRCA1表达的新机制，并发现去势治疗（ADT）诱导的BRCA1激活通过NRF2通路增强抗氧化防御，为前列腺癌（PCa）治疗耐药性提供了新的分子解释。

　　

Abstract

致死性前列腺癌（PCa）是一种具有遗传异质性的疾病，其特征是不断演变的雄激素受体（AR）信号传导，最终导致去势抵抗。肿瘤抑制基因BRCA1具有多种功能，包括作为基因组完整性守护者的主要功能之外的次要过程协作。BRCA1在乳腺癌和卵巢癌中经常发生突变，但BRCA1突变也与前列腺癌相关，尽管观察到的频率较低。然而，大多数前列腺癌患者并不携带BRCA1突变，有趣的是，研究表明BRCA1表达在去势抵抗性前列腺癌中富集。本研究阐明了BRCA1蛋白在前列腺组织中的特异性作用。

Introduction

BRCA1是一种肿瘤抑制因子，通过其在DNA损伤反应（DDR）中的核心作用支持基因组完整性，其 specifically involved in the repair of double-strand DNA breaks by homologous recombination (HR)。因此，当BRCA1功能丧失时，体细胞致癌 alterations 更有可能被纳入DNA，从而诱导致癌作用或癌症进展。此外，BRCA1作为转录因子和泛素连接酶复合物的一部分，在细胞中具有多效性作用，涉及细胞周期、中心体功能和免疫系统。与各种基本功能以及维持基因组完整性的作用相一致，BRCA1敲除是胚胎致死的，BRCA1种系突变是杂合性的，而BRCA1体细胞突变需要伴随突变（如p53）的存在。BRCA1还防止抗氧化反应的主要调节因子核因子红细胞2相关因子2（NRF2）的降解。这种 secondary effect 通过保护细胞免受活性氧（ROS）的影响，从而支持基因组完整性，与肿瘤抑制基因功能协同作用。

DDR基因在前列腺癌中经常发生突变，在高达20-30%的去势抵抗性前列腺癌（CRPC）病例中观察到 alterations。大多数突变靶向BRCA2，而BRCA1突变仅在1%–2%的患者中发现。先前的临床前研究表明，前列腺癌中雄激素受体（AR）信号传导与DDR之间存在相互作用。然而，结果是相互矛盾的，并且这些发现的解释仍然复杂。例如，虽然该领域有影响力的工作表明AR激活促进DDR，但来自主要前列腺癌患者数据集的数据似乎 paradoxically 表明BRCA1表达在CRPC中富集。增加这种复杂性的是，抗雄激素恩杂鲁胺在临床前模型中降低了BRCA1表达。重要的是，AR通过其天然配体或雄激素剥夺（AD）对BRCA1蛋白的调节尚未报道。大多数研究反而依赖于有限数量的合成雄激素、AR抑制剂或小RNA，而不是系统的生理学方法，或者它们报道了对DDR基因的影响，但排除了BRCA1。

Materials and methods

本研究使用了前列腺癌细胞系VCaP（AR扩增，TP53突变，TMPRSS2-ERG融合）、LNCaP（AR突变，CHEK2-SNV，PTEN缺失）、22Rv1（AR剪接变体，BRCA2突变，ATM-SNV，TP53突变，TMPRSS2–ERG融合）和PC-3（AR阴性，PTEN缺失）。因此，使用了三种具有不同AR信号状态的AR阳性细胞系。

为了研究AR激活后BRCA1蛋白水平的变化，我们首先用模拟AD条件的高度AR反应性VCaP细胞系预处理96小时。在此期间的最后24、48和72小时，我们用不同浓度的DHT（0.05–10 nM）进一步刺激细胞，所有细胞在96小时时间点裂解。DHT处理在0.5–10 nM浓度之间增加了AR转录靶蛋白PSA和FKBP5的水平。相反，BRCA1蛋白以剂量依赖性方式下调。作为DNA损伤的读数，γH2Ax被下调，特别是在 later timepoints。另一个 essential HR蛋白，Rad51，也被下调。这些结果表明，与AR激活诱导DDR基因表达的先前报道相反，BRCA1和Rad51表达水平被下调。

AR信号传导在LNCaP细胞中 similarly 被刺激。正如对AR amplification程度较低的细胞系所预期的那样，PSA和FKBP5反应较不极端，但仍然是高度剂量依赖性的，而所有读数的趋势与VCaP细胞的结果相匹配，只有Rad51达到显著性。这些结果暗示，与已知的靶基因不同，HR蛋白BRCA1和Rad51在用天然配体刺激AR后没有被上调。

我们还检查了前列腺癌患者、患者来源的类器官和患者来源的异种移植数据集中的BRCA1和AR转录靶mRNA之间的相关性。数据集显示出负相关的趋势，进一步支持了AR激活对BRCA1的可能抑制功能。

接下来，我们想确定AR激活如何介导BRCA1下调。BRCA1似乎在与上调的AR靶标相似的剂量和时间点被相反地调节，这表明BRCA1在转录水平上受AR激活的调节。为了测试这一点，我们在经受10 nM DHT或 vehicle after AD 的VCaP细胞中进行了RT-qPCR，并观察到响应AR刺激的BRCA1 mRNA水平下调。合成雄激素R1881（1 nM）也以与DHT comparable 的方式下调VCaP细胞中的BRCA1。类似地，在LNCaP细胞中观察到显著减少。通过分析已发表的RNA数据集，也观察到了BRCA1 mRNA对R1881的反应。这表明AR激活通过抑制其转录来抑制BRCA1。

AD induces DNA damage and activates BRCA1 in PCa cells

我们使用补充有无固醇血清的培养基来剥夺AR的配体，以模拟ADT。正如预期的那样，VCaP和LNCaP细胞显示PSA下调，而具有高AR-V7表达的22Rv1保留PSA表达。

我们观察到在AD条件下VCaP和LNCaP细胞中总BRCA1上调，表明AR介导的BRCA1抑制在AD后被废除。相反，这种效应在LNCaP细胞中似乎是 transient 的，但在VCaP细胞中是 sustained 的。在22Rv1细胞中，没有明显的PSA对AD的反应，BRCA1水平是恒定的，表明BRCA1仍然被组成型AR-V7激活所抑制。这支持了BRCA1蛋白水平与AR活性相关的结论。我们在所有细胞系中观察到上调的γH2Ax和 cleaved caspase-3 水平，值得注意的是，在22Rv1细胞系中也是如此。我们还观察到在所有细胞系中磷酸化BRCA1（pBRCA1）水平增加，表明其被激活。这表明BRCA1激活的调节与其表达的调节是分开的，并且可能是由前列腺癌中AD相关的DNA损伤过程诱导的。

观察到Rad51在所有细胞系中都有下调的趋势，在VCaP和22Rv1细胞中达到显著性。这表明与BRCA1不同，Rad51与AR激活没有简单的负相关。

作为参与细胞生长、存活和蛋白质合成调节的PI3K-Akt/mTOR信号通路读数的S6和Akt，在响应AD时显示出磷酸化的初始激增，但在VCaP和22Rv1细胞的 later timepoints 被强烈去磷酸化。毫不奇怪，这种模式在LNCaP细胞中不存在于Akt，并且对于磷酸化S6（pS6） barely detectable，其中由于PTEN缺失导致的组成型Akt激活可能限制了进一步的磷酸化。

总之，我们的结果表明，BRCA1水平在显示PSA降低的条件下被诱导，进一步支持了AR激活介导BRCA1水平抑制的观点。此外，γH2Ax、cleaved caspase-3和pBRCA1在所有细胞系中都被AD诱导，与PSA反应无关。这表明AR调节BRCA1表达，而BRCA1磷酸化似乎主要由DNA损伤过程启动，与AR无关。

ADT induces DNA damage and BRCA1 phosphorylation in murine VCaP xenografts

为了评估我们研究结果的体内可重复性，我们使用了ADT的小鼠VCaP异种移植模型。如预期，响应ADT，观察到表明肿瘤消退和伴随PSA下降的趋势，表明减少的AR可能导致异种移植肿瘤中的细胞死亡。

接下来，我们使用γH2Ax、pBRCA1、Rad51和pS6抗体对异种移植肿瘤进行IHC，并测量强阳性染色的相对面积。我们基于第2天VCaP异种移植物的染色观察到诱导的γH2Ax、增加的pBRCA1、减少的Rad51和减少的pS6，与我们早期的VCaP细胞结果相匹配，表明这些蛋白确实在体内被调节。第5天的样本显示出类似的趋势，尽管变异性更大，这可能源于到该 later timepoint 时受影响最严重的细胞已经死亡。一个巨大的突然DNA损伤事件，如果得不到充分解决，很可能导致细胞死亡。因此，在 later timepoints 存活的细胞可能变得富含未受影响的细胞， potentially contributing to the observed variability。重要的是，pBRCA1染色与PSA负相关，进一步证明AR活性与BRCA1呈负相关。有趣的是，在单独分析完整组时，这种相关性也很明显，表明AR活性对BRCA1的调节在没有干预的情况下已经 significant。总之，这些数据支持我们的发现，即AD诱导DNA损伤并增加BRCA1激活。

ADT induces expression and phosphorylation of BRCA1 and increases DNA damage in clinical PCa specimens

我们进一步研究了临床前列腺癌肿瘤中BRCA1、pBRCA1和γH2Ax的蛋白表达是否在ADT后发生改变，类似于我们的体外和体内模型。对11名前列腺癌患者的配对样本（全部为原发性肿瘤）和ADT后（64%来自转移灶，64%为CRPC）通过使用针对BRCA1、pBRCA1和γH2Ax的抗体进行IHC分析。基于IHC染色评分，除一例外，所有病例中BRCA1、pBRCA1和γH2Ax在ADT后均上调，表明DNA损伤和活性磷酸化-BRCA1在ADT后变得富集，并可能有助于ADT耐药性的发展。

AD induces BRCA1 together with the antioxidant transcription factor NRF2

我们研究了先前发表的来自BRCA1沉默的前列腺癌细胞的转录组数据。为了评估在BRCA1抑制期间可能丢失并在BRCA1激活期间促进的过程，我们专注于在BRCA1沉默细胞中下调的基因。我们观察到差异表达基因显示出与 already had an established association with BRCA1 的生物过程和标志相关的基因集的最高关联。值得注意的是，与在该前列腺癌细胞系中看到的变化相关的最重要的致癌基因集是一组NRF2调节的基因。AD已被 suggested to increase the expression of antioxidant markers and ROS in PCa cells，这与去势抵抗有关。我们假设ROS可能部分地与观察到的BRCA1磷酸化作为对AD的普遍反应有关，因为BRCA1磷酸化位点激活剂ATM也直接由ROS激活。NRF2是抗氧化合成的重要主转录因子。BRCA1先前被报道通过物理相互作用 with NRF2 and promoting its stability and activation 来调节NRF2依赖性抗氧化信号。在这里，我们观察到5天的ADM上调了BRCA1和NRF2表达。此外，ADM诱导的BRCA1表达在NFE2L2（NRF2）敲低后被阻断。这些数据表明NRF2确实参与响应AD的BRCA1调节。

The BRCA1-NRF2 regulatory axis regulates PCa cell spheroidal growth

接下来，我们检查了修饰的BRCA1表达在前列腺癌细胞中的 effects。我们选择使用siRNA进行基因沉默， given its ability to partially retain protein expression， thereby protecting cell viability from the complete loss of essential functions of BRCA1。在沉默BRCA1后，在LNCaP细胞的2D培养中没有观察到存活率的差异；然而，观察到LNCaP细胞球体的尺寸减小了54.5%。在AR阴性的PC-3细胞中，BRCA1敲低对2D培养中的细胞汇合没有显著影响，但3D中的球体减小了84.5%，与LNCaP细胞相似。总之，这表明BRCA1的功能在富含ROS的3D培养环境中对前列腺癌细胞更重要。

有趣的是，沉默NFE2L2减小了LNCaP细胞中的球体尺寸，类似于沉默BRCA1。此外，在LNCaP细胞中沉默BRCA1下调了3D培养中NRF2靶基因NQO1和FTH1的蛋白产物。在PC-3细胞中，沉默BRCA1同样导致NRF2靶标以及NRF2本身的下调。这些结果表明在前列腺癌细胞中存在BRCA1和NRF2的双向调节轴。

虽然BRCA1在前列腺癌中众所周知会发生突变，并且是前列腺癌易感DDR基因之一，但我们发现扩增的BRCA1在已发表的队列中 also observed at similar rates compared to mutations。此外，我们发现神经内分泌前列腺癌（NEPC）特征在转移性CRPC中BRCA1高表达水平的患者中更常见。这一点以及BRCA1在所有广泛使用的前列腺癌细胞系中都有表达的事实表明，BRCA1表达在非BRCA1突变的前列腺癌中仍然普遍存在。

我们检查了公共患者数据集中的BRCA1表达，发现高BRCA1表达与TCGA中较短的无进展生存期和MSK队列中较短的无病生存期相关，而对总生存期的影响在TCGA中不显著。此外，我们发现BRCA1高表达和几个已知的NRF2调节基因与SU2C数据集中转移性CRPC患者较差的总生存期相关。总之，这些数据表明高BRCA1表达在进展性前列腺癌中普遍存在。在所分析的队列中BRCA1突变的频率很低，因此，低BRCA1组并不代表基因组BRCA1丢失的侵袭性表型。因此，可以 plausible that the observed survival correlations were a consequence of AR activation-mediated modulation of the BRCA1-NRF2 regulatory axis。因此，我们得出结论，肿瘤抑制基因BRCA1在ADT时因其抗氧化特性而被表达和激活，并在过度活跃的AR信号传导期间被抑制，推测通过其肿瘤抑制功能的丧失加剧了进展。

Discussion

前列腺癌的临床前研究表明AR信号传导调节DDR。然而，这些研究的结果部分是相互矛盾的，并且AR的天然配体或ADT对BRCA1的调节尚未报道。此外，与其它HR易感癌症（如乳腺癌和卵巢癌）中观察到的高频率相比，在前列腺癌中观察到的BRCA1突变频率低的原因仍然无法解释。因此，我们试图系统地表征AR对BRCA1的调节，并探索BRCA1在前列腺癌中的功能。

我们的结果表明，配体对AR的激活介导了BRCA1转录的抑制。AR激活与BRCA1表达之间的负相关得到了我们的小鼠异种移植数据和in silico分析的进一步强化。BRCA1已被 suggested to be repressed by Id4, the E2F family of transcription factors, Slug, and microRNAs。这表明AR可能调节或与这些或其他尚未识别的抑制因子相互作用，或者它直接抑制BRCA1。在乳腺癌和卵巢癌中发现的BRCA1突变频率与其它癌症类型相比很高。这被 hypothesized to result from other tissues not surviving without BRCA1 expression。我们的发现证明BRCA1在AR激活下被抑制，为AR驱动的前列腺癌抑制可能 transiently impair the tumor suppressor function of BRCA1，从而支持致癌 alterations 的积累的 hypothesis 提供了理由。因此， already impaired tumor suppressor gene function would provide no selective pressure toward somatic BRCA1 mutations。另一方面，我们发现ADT激活BRCA1以防御ROS，这反过来可能选择 against somatic BRCA1 mutations。

有趣的是，ADM诱导DNA损伤和凋亡，同时增加BRCA1表达或磷酸化，与AR激活无关。这表明BRCA1磷酸化可能对其它AD诱导的过程（如ROS）更敏感。或者，假定的去磷酸化或BRCA1磷酸化的抑制可能需要不存在于22Rv1中存在的非全长AR-V7中的结构域的核定位，因为全长AR在AD期间保持细胞质。此外，我们证明了AD similarly induced both BRCA1 and NRF2，并且在特定条件下（如AD、类器官培养或AR阴性细胞）沉默BRCA1或NFE2L2导致相互下调，这表明ROS的参与。AD诱导ROS介导的氧化应激，并且BRCA1调节并与NRF2相互作用。我们的数据揭示了BRCA1-NRF2调节轴在前列腺癌中是活跃的，并且 potentially hijacked by CRPC to defend against toxic ROS。

患者数据表明，高BRCA1表达与前列腺癌患者的不良预后有关。高BRCA1水平也被发现与神经内分泌前列腺癌特征相关。有趣的是，最近一项患者来源的类器官研究表明，神经内分泌前列腺癌样本中DDR基因表达增加，这表明AR独立性与一些DDR基因的功能增加有关。这补充了我们的发现，即虽然BRCA1似乎在AR驱动的前列腺癌中与AR激活相关被抑制，但其表达在较少AR依赖的前列腺癌中不受影响。

总之，我们的研究阐明了肿瘤抑制因子BRCA1在前列腺癌中的作用。遗传性BRCA1突变与侵袭性前列腺癌的易感性有关，但大多数前列腺癌患者仍然携带完整的BRCA1。我们证明AR介导BRCA1抑制，并且ADT在前列腺癌中激活而不是抑制BRCA1表达。因此，我们提出BRCA1在未突变时在前列腺癌中扮演两个不同的角色：首先，作为被抑制的肿瘤抑制因子， thus putatively promoting tumorigenesis and progression and, in the later stage, through ADT-mediated activation, to protect tumor cells against ROS by inducing NRF2 and its targets。