GmNRF5a–GmCERK1–GmCAK1模块介导大豆中几丁质/壳聚糖寡糖触发免疫应答的分子机制

本研究发现大豆通过GmNRF5a和GmCERK1受体直接识别几丁质寡糖（CTOS）和壳聚糖寡糖（CSOS），并揭示GmCAK1作为下游关键激酶调控免疫信号传导。该研究阐明了大豆应对真菌病原体入侵的新机制，为开发广谱抗病作物提供了重要分子靶点和理论依据。

　　

引言

植物在自然环境中持续暴露于细菌、真菌和卵菌等潜在病原体。为抵御病原入侵，植物进化出多层次的免疫系统，包括病原相关分子模式（PAMP）触发免疫（PTI）和效应子触发免疫（ETI）。几丁质是真菌细胞壁的主要成分，其寡糖衍生物CTOS被植物模式识别受体（PRRs）识别为PAMP，从而诱导先天免疫。在拟南芥和水稻中，CTOS的识别需要膜定位的含溶素基元（LysM）结构域受体AtLYK5和OsCEBiP。然而，壳聚糖寡糖（CSOS）诱导植物免疫的机制尚不明确。

几丁质/壳聚糖寡糖触发大豆免疫反应并增强对大豆疫霉的抗性

通过酶解虾蟹外骨骼制备不同聚合度（dp）的几丁质寡糖（CTOS）和壳聚糖寡糖（CSOS）。CTOS（dp2-6）和CSOS（dp2-8）经ESI-MS和HILIC-HPLC分析纯化，NMR结果显示CSOS完全脱乙酰化。CTOS（dp5和dp6）可诱导大豆叶片产生强烈的活性氧（ROS）爆发，而CSOS（dp4-6）未引发ROS爆发，这与脱乙酰化削弱免疫反应的报道一致。CTOS和CSOS均能诱导MAPK磷酸化，水平显著高于对照。大豆黄化下胚轴预处理flg22、CTOS（dp6）或CSOS（dp6）后接种大豆疫霉（Phytophthora sojae）游动孢子，CTOS和CSOS处理组的病原菌生物量显著降低，表明二者均能增强大豆对大豆疫霉的抗性。

GmNFR5a和GmCERK1是CTOS/CSOS触发免疫应答所必需的

对被子植物中潜在LysM受体的进化分析显示，大豆GmNFR5a（属于G2簇）和GmCERK1（属于G1簇）可能参与CTOS/CSOS识别。利用苹果潜隐球形病毒（ALSV）沉默大豆中所有LysM蛋白编码基因，发现沉默GmCERK1或GmNFR5a后，CTOS（dp6）诱导的ROS爆发和MAPK激活明显减弱或消除，但不影响flg22诱导的免疫反应。CSOS（dp6）诱导的MAPK激活在沉默植株中也显著降低。大豆发根RNAi实验进一步证实，沉默GmCERK1或GmNFR5a削弱了CTOS/CSOS诱导的对大豆疫霉的抗性，而沉默GmLYK5（拟南芥AtLYK5的同源物）影响不显著，表明GmNFR5a和GmCERK1在大豆CTOS/CSOS触发免疫中起关键作用。

CTOS和CSOS直接结合GmNFR5a和GmCERK1

通过微量热泳动（MST）分析发现，GmCERK1^ECD与CTOS和CSOS的解离常数（K_D）分别为3.25±0.95 mM和10.59±1.46 mM，GmNFR5a^ECD与CTOS和CSOS的K_D分别为20.54±6.07 mM和7.04±2.62 mM，表明GmNFR5a^ECD对CSOS的亲和力高于CTOS。分子对接预测显示，GmCERK1^ECD和GmNFR5a^ECD的LysM2结构域与CTOS（dp4）或CSOS（dp4）结合。GmCERK1^ECD的Tyr109和Ile137是CSOS结合的关键位点，突变后削弱CSOS结合但不影响CTOS结合；Pro134和Pro138突变增强CSOS结合活性。GmNFR5a^ECD的Phe124和Leu153是CSOS结合的关键位点，突变后削弱CSOS结合但增强CTOS结合；Ser123/Thr126和Pro150突变增强CTOS和CSOS结合活性。

GmCERK1/GmNFR5a介导CTOS/CSOS诱导免疫的关键位点功能验证

在本氏烟中异源表达GmCERK1和GmNFR5a及其突变体，发现过表达野生型蛋白显著增强CTOS/CSOS诱导的抗病性。GmCERK1和GmNFR5a、、突变体进一步增强了CTOS触发的ROS爆发。GmCERK1增强CSOS诱导的MAPK激活，而和减弱该激活。大豆发根过表达实验表明，GmCERK1削弱CTOS诱导的免疫，而GmNFR5a和增强该免疫。GmCERK1、和GmNFR5a显著降低CSOS诱导的MAPK活性，而GmCERK1和GmNFR5a增强该活性。过表达GmCERK1和GmNFR5a增强CTOS/CSOS诱导的抗病性，但、和突变抑制CSOS触发的抗病性，突变增强对CTOS和CSOS的抗性。

GmNFR5a与GmCERK1在CTOS/CSOS存在下互作

GFP标记的GmCERK1和GmNFR5a定位于细胞外周，与质膜标记Remorin共定位。Co-IP、BiFC和GST pull-down实验证明GmCERK1和GmNFR5a均能形成同源二聚体，且二者在CTOS/CSOS存在下发生互作。体外磷酸化实验显示GmCERK1具有自磷酸化活性，而GmNFR5a无此活性，且二者间无交叉磷酸化。表明GmNFR5a可能作为无活性的RLK感知几丁质寡糖，而GmCERK1负责信号转导。

GmCAK1介导CTOS/CSOS触发免疫应答和病原抗性

通过Co-IP和LC-MS/MS鉴定出GmCERK1互作蛋白GmCAK1（CERK1关联激酶1），该蛋白定位于质膜，无胞外域。沉默GmCAK1后，CTOS/CSOS诱导的ROS爆发和MAPK激活显著减弱，且CTOS诱导的抗大豆疫霉能力降低。Co-IP、GST pull-down和BiFC实验证实GmCERK1与GmCAK1互作，且该互作在CTOS/CSOS存在下减弱。体外激酶实验显示GmCAK1具有自磷酸化活性，GmCERK1^CD可磷酸化GmCAK1^CD，而GmCAK1^CD不能磷酸化GmCERK1^CD，表明GmCAK1位于GmCERK1下游，在信号转导中起关键作用。

讨论

该研究揭示了大豆通过GmNFR5a–GmCERK1复合物激活CTOS/CSOS信号传导。虽然CTOS和CSOS结合机制略有差异，但二者均能诱导GmNFR5a和GmCERK1形成异源多聚体，通过GmCAK1协同转导下游信号。GmCERK1对CTOS的亲和力高于CSOS，其在CTOS免疫信号传导中作用更为重要。GmNFR5a是首个发现的调控CSOS信号的免疫组分，其关键结合位点（Phe124和Leu153）对CSOS结合至关重要。GmCAK1作为保守的受体激酶，在CERK1介导的信号转导中发挥通用作用。该研究为利用CSOS作为环保农业产品提供了分子基础，并通过受体工程改良为培育广谱抗病作物提供了新策略。