利用完整的叶绿体基因组数据，研究Batrachospermaceae科（Batrachospermales目，红藻门）中7个淡水红藻属之间的系统发育关系

《Journal of Phycology》：Phylogenetic relationships among seven freshwater red algal genera in the Batrachospermaceae (Batrachospermales, Rhodophyta) using complete chloroplast genome data

形态与分子协同分析揭示红藻 Batrachospermales 七个属的系统发育关系，基于132个叶绿体编码基因的系统发育树显示强支持，与形态特征一致。研究证实叶绿体基因组数据能有效解析属间进化关系，为红藻分类系统提供新证据。

　　在淡水红藻目Batrachospermales中，系统发育研究通常仅依赖于一到几个基因来推断进化关系。这些研究构建的系统发育树在某些属的单系性方面得到了较强的统计支持，但在属之间的关系上往往支持不足。因此，研究人员开始探索利用叶绿体基因组测序的方法，以期获得更加清晰和有支持性的系统发育树。本研究聚焦于一个包含七个属的亚群，并对其中的10个物种进行了叶绿体基因组测序。通过整合新数据与已有数据，研究人员利用132个叶绿体编码基因构建了系统发育树，结果发现这七个属之间的关系均获得了较强的统计支持。此外，系统发育树与这些属的总体形态特征表现出了一致性。例如，具有管状假被丝结构的Gametophyte（配子体）的属Lemanea和Paralemanea形成一个单系群，而具有珠状Gametophyte的属Batrachospermum、Lympha、Sirodotia、Tuomeya和Volatus则形成另一个单系群。在后一单系群中，Batrachospermum的配子体为带柄的，而其他三个属的配子体为轴向的，Sirodotia的配子体则沿轴向扩散。这些结果表明，叶绿体基因组数据在澄清Batrachospermales属间进化关系方面具有巨大潜力，为未来研究该类群的更广泛进化历史提供了新的方向。

Batrachospermales是红藻门Rhodophyta中的一个目，其主要成员为淡水物种，主要分布在流动水域中。该目在全球范围内均有分布，但并未在南极洲发现。目前，Batrachospermales包括23个属，其中一些属仅分布于单一大陆（如Tuomeya仅见于北美洲），而其他属则分布更为广泛（如Sirodotia在非洲、亚洲、澳大利亚、欧洲以及南北美洲均有记录）。属的分布范围差异可能是由于其生命周期中的某些特征，如远距离传播和适应多种环境条件的生理特性。Batrachospermales的成员具有明显的配子体（Gametophyte）和两个较小的二倍体阶段，即chantransia和carposporophyte。chantransia经历无性减数分裂，形成配子体，而在受精后，carposporophyte会附着于配子体上，并释放出二倍体carpospores，这些carpospores又会萌发为新的chantransia。所有用于形态学鉴定的特征均来源于配子体及其carposporophyte的配置。配子体的总体形态可以是珠状无外层皮质、珠状且具有外层皮质的假被丝结构，或者是管状且具有外层皮质的假被丝结构。同样，carposporophyte的位置、大小以及carpogonium（雌配子）的特征对于物种和属的分类具有诊断意义。

除了形态学研究，DNA序列数据也被用于Batrachospermales的系统发育研究。早期的DNA序列研究显示，Batrachospermum是并系的（paraphyletic），这促使后续的分类修订工作主要集中在识别单系的属上，通常通过将基于形态学特征明确的Batrachospermum的某些节（section）提升为属，并描述每个新定义属中的物种多样性。例如，Batrachospermum的三个节Virescentia、Macrospora和Turfosa被分别提升为属Virescentia、Montagnia和Paludicola。此外，一些分子系统发育研究揭示了隐藏的多样性，促成了包括Lympha、Notohesperus和Volatus在内的新属的描述，这些属在外表上与其它属相似，但具有独特的形态特征。

然而，Batrachospermales的分子系统学研究通常只使用一到三个基因来推断进化关系。虽然这些研究成功地支持了属的建立以及每个属内物种之间的关系，但在属之间的关系上却难以获得强支持。在红藻门中，仅使用两到三个基因的多基因数据集未能解析出红藻类之间的关系，而一个九基因的数据集也无法解析Nemaliophycidae亚目中的属间关系。为了更好地解析红藻门中的深层次关系，Verbruggen等人（2010）建议使用高通量基因组数据，特别是对于那些难以解析的类群。

基于之前的发现，研究人员认为需要更多的序列数据来进一步理解Batrachospermales属间的进化关系。一些对海洋红藻的研究已经采用叶绿体基因组测序的方法，将多个基因串联起来，从而获得支持度较高的系统发育树。例如，一项对Nemaliales目系统发育的研究使用了195个叶绿体编码基因，构建了完整的系统发育树，并确认了六个科的单系性，推断了属之间的关系。对于Ceramiales目，研究人员使用了206个叶绿体编码基因来解析属和科之间的关系，获得了该目支持度较高的系统发育树。这种深层次的系统发育解析有助于研究藻类的形态结构进化、不同生命周期策略之间的转换，以及其他重要的生物特征。

本研究采用了叶绿体基因组的全基因组方法，以期提高Batrachospermales属间系统发育关系的解析能力。目前已有10个叶绿体基因组数据，但这些数据不足以构建一个全面的系统发育树。因此，构建一个支持度高的系统发育树对于探索进化问题至关重要，如将形态和繁殖特征映射到系统发育树上，以理解传播和多样化过程。在全面研究Batrachospermales的所有23个属之前，研究人员选择了一个具有较强支持的七个属的亚群——Batrachospermum、Lemanea、Lympha、Paralemanea、Sirodotia、Tuomeya和Volatus——来评估叶绿体基因组在解析属间关系中的有效性。这一亚群涵盖了Batrachospermales的多种形态结构和多样性，为未来建立稳健的系统发育树后研究特征进化奠定了基础。因此，本研究的目标是评估叶绿体基因组数据在推断这七个属之间关系的有效性，并基于构建的系统发育树评估关键的分类特征。

在本研究中，研究人员选择了七个属作为研究对象，并对每个属中的当前已知物种进行了识别。这些属包括Batrachospermum（6个物种）、Lemanea（8个物种）、Lympha（1个物种）、Paralemanea（9个物种）、Sirodotia（9个物种）、Tuomeya（1个物种）和Volatus（3个物种）。在评估现有叶绿体基因组数据后，研究人员补充了数据，确保每个属至少有两个物种的数据。来自北美的10个物种的标本被获取，并保存在硅胶中，随后在-20°C下存储。这些标本被存放在Ohio University的Floyd Bartley Herbarium（BHO）。标本的鉴定基于文献中的诊断形态学特征，并通过比较rbcL基因序列与GenBank中的序列，使用Benson等人（2014）的方法进行验证。

DNA提取和测序采用了两种提取方法和三种测序平台。对于某些物种，研究人员使用了液氮研磨法和Nucleospin Plat II试剂盒进行DNA提取，并按照制造商的协议进行操作，同时增加了2小时的裂解步骤以提高Lemanea和Paralemanea物种的DNA提取效率。对于其他材料，研究人员使用了珠磨仪和改良的CTAB提取法，并结合Polyvinylpyrrolidone-10进行处理。DNA的数量和质量通过NanoDrop ND-1000分光光度计、Qubit 3荧光计和Agilent 4150 TapeStation进行评估。

在测序过程中，研究人员使用了Illumina NovaSeq、MiSeq或NovaSeq X Plus平台。对于NovaSeq平台，Ohio University的基因组学设施使用Nextera XT DNA Library Prep试剂盒构建了350核苷酸的片段库。对于MiSeq平台，研究人员使用NEBNext Ultra II FS DNA Library Kit构建了200–450核苷酸的片段库。对于NovaSeq X Plus平台，SeqCenter使用Illumina DNA Prep试剂盒构建了280核苷酸的片段库。

叶绿体基因组的组装和注释过程包括对每个测序方法得到的读取数据进行修剪、配对，并使用Geneious Prime 2024.0.7进行初始的从头组装。研究人员使用已发表的Batrachospermum qujingense的叶绿体基因组作为参考，识别出包含叶绿体基因组片段的contigs，并通过迭代映射配对读取数据，直到获得完整的叶绿体基因组序列。对于Paralemanea grandis和Volatus personatus，由于某些原因，完整的叶绿体基因组未能获得。研究人员通过分析已发表的Batrachospermum qujingense的叶绿体基因组，确认了所有rRNA和蛋白编码基因的注释，并用于其他属的注释。此外，研究人员使用tRNAscan-SE工具对tRNA基因进行了注释，并通过Find ORFs功能确认了所有蛋白编码基因的起始和终止密码子。最终，研究人员使用Batrachospermum gelatinosum的注释基因组作为参考，对其他属的基因组进行了注释。

为了评估基因组的共线性，研究人员使用了ProgressiveMauve算法，该算法能够自动计算种子权重和最小的局部共线块（LCBs）得分。这一方法揭示了完整的叶绿体基因组之间高度的共线性，表明这些基因组的结构在进化过程中保持相对稳定。

在系统发育分析中，研究人员采用了两种方法：一种是仅使用rbcL基因进行分析，另一种是使用所有共有的叶绿体编码基因进行多基因分析。对于rbcL基因的单基因分析，研究人员使用了最大似然法（ML）和1000次超快速Bootstrap支持分析。而对于多基因分析，研究人员使用了132个蛋白编码基因，并通过ModelFinder在IQ-Tree 2.3.5中确定了最佳拟合模型。最终的系统发育树显示，这七个属之间的关系得到了较强的统计支持，尤其是在多基因分析中，所有内部分支均获得了95–100%的支持度。然而，在单基因分析中，某些属之间的关系支持度较低，如Tuomeya与Batrachospermum之间的关系仅获得了55%的支持度，而Lympha与Volatus之间的关系则获得了85%的支持度。这种差异可能反映了单基因分析在解析属间关系时的局限性，而多基因分析则提供了更全面的视角。

在形态学特征方面，研究人员收集了七个属的文献数据，并通过显微镜和相机对这些特征进行了详细记录。Lemanea和Paralemanea的配子体具有管状假被丝结构，并且带有外层皮质。Tuomeya的配子体则呈现出珠状结构，但同样具有外层皮质。Batrachospermum、Lympha、Sirodotia和Volatus的配子体具有非融合的束状结构，呈现出珠状排列的外观。此外，Lemanea、Lympha、Paralemanea、Sirodotia、Tuomeya和Volatus的carpogonial枝（雌配子枝）较短，而Batrachospermum的carpogonial枝较长，导致其carposporophyte为带柄的结构。Sirodotia的carposporophyte呈现出球状或近球状，其 gonimoblast filament（生成孢子的细胞）从少数中心细胞辐射出去，并终止于carposporangia（孢子囊）。而Tuomeya和Volatus的carposporophyte则与主轴紧密相连，呈现出较大的轴向结构。这些形态学特征与系统发育树中的分类结果一致，表明叶绿体基因组数据在解析属间关系时具有较高的准确性。

在讨论部分，研究人员指出，本研究在Batrachospermales中补充了八个完整的叶绿体基因组和两个部分基因组，这些数据与之前的研究结果一致，表明该目中的叶绿体基因组具有高度的保守性。例如，完整的叶绿体基因组通常包含两个反向重复（IR）区域，其中包含完整的核糖体基因簇（16S、5S和23S rRNA基因）。然而，Sirodotia delicatuliformis的叶绿体基因组仅包含一个核糖体基因簇，这可能与其独特的进化路径有关。尽管如此，Batrachospermales中的叶绿体基因组结构与许多其他红藻的结构相似，表明该目在进化过程中保持了较高的基因组结构稳定性。

此外，研究人员还发现，多基因分析比单基因分析更能解析Batrachospermales属间关系。例如，使用单个rbcL基因构建的系统发育树中，某些节点的支持度较低，而使用多基因数据构建的系统发育树则在所有节点上均获得了较高的支持度（bs ≥95）。这一结果表明，叶绿体基因组在解析Batrachospermales属间关系方面具有更大的优势。这可能与叶绿体基因组的较大基因含量和序列长度有关，本研究分析了132个叶绿体基因，而Da Silva等人（2025）在利用线粒体基因组进行研究时仅分析了17个基因。因此，叶绿体基因组的多基因分析可能为Batrachospermales的系统发育研究提供更全面的数据支持。

最后，研究人员提到，尽管本研究对七个属的叶绿体基因组进行了分析，但整个Batrachospermales目中仍有其他属未被研究，这些属的形态多样性可能需要进一步的系统发育分析。例如，Petrohua和Psilosiphon是两种管状配子体的属，但它们在之前的两基因分析（rbcL和LSU）中被归为远亲关系，而这两个基因不足以解析它们与其他属之间的关系。因此，研究人员认为，将系统发育分析扩展到整个Batrachospermales目将有助于构建一个更加清晰和有支持性的系统发育树，从而更好地理解该目中关键形态和繁殖特征的进化历史。