高电导率样本中生物分子相互作用的精准定量：毛细管电泳技术新策略与应用拓展

本综述系统探讨了毛细管电泳（CE）在高电导率样本中生物分子相互作用定量分析面临的挑战与创新解决方案。研究通过模拟与实验相结合，揭示了样本缓冲液与背景电解质（BGE）电导率不匹配导致的峰畸变现象（如峰分裂、展宽），并提出通过优化进样条件、选择性排除伪峰以及基于"去堆积"（de-stacked）组分的定量新方法，显著提升了亲和探针毛细管电泳（APCE）和非平衡毛细管电泳（NECEEM）在生理缓冲条件（如PBS）下的分析准确性。该工作为在非理想电导条件下精准测定解离常数（Kd）和希尔系数（n）提供了实用策略，拓展了CE在生物分析中的应用边界。

　　

1 引言

生物分子相互作用的定量分析是生物化学研究的核心，对疾病诊断、药物开发和分子通路解析具有重要意义。毛细管电泳（CE）因其高速、低样本消耗和自动化潜力成为重要工具，但当样本缓冲液电导率高于背景电解质（BGE）时，会出现峰畸变和测量精度下降问题，尤其在亲和探针毛细管电泳（APCE）和非平衡毛细管电泳（NECEEM）中更为显著。本研究聚焦适配体-蛋白质相互作用，通过模拟与实验结合，系统分析了电导率不匹配对CE分离的影响，并提出了改进策略。

2 材料与方法

研究使用荧光标记的DNA适配体（如FAM标记的凝血酶结合29mer和整合素靶向S10yh2）与蛋白质（凝血酶、人血清 albumin（HSA））作为模型体系。样本在Tris-甘氨酸（TG）或磷酸盐缓冲液（PBS）中制备，CE分离在低电导BGE（如30 mM tricine）中进行。实验采用Sciex P/ACE MDQ Plus仪器，通过紫外吸收和激光诱导荧光（LIF）检测，结合Simul 6软件进行迁移行为模拟。荧光各向异性（FA）实验用于验证结合参数。

3 结果与讨论

电导率不匹配的影响

当样本缓冲液电导率高于BGE时，CE分离出现显著异常。中等电导差异（如2×TG样本 vs. 30 mM tricine BGE）导致峰分裂，而高差异（PBS样本 vs. tricine BGE）则产生宽峰，使游离和结合物种无法区分（图1）。模拟显示，分析物离子被困在高电导样本塞中，迁移延迟，形成伪峰（图2）。进样时间延长加剧该现象，缩短进样时间（如从5s减至3s）可减少伪峰面积（图3）。

结合定量的准确性优化

在峰分裂存在时，积分方法影响结合参数计算。排除分裂峰（Method 2）所得解离常数（K_d）和希尔系数（n）更接近荧光各向异性（FA）参考值（图4，表1）。例如，3s进样时，K_d=37.6±8.7 nM（排除伪峰）与FA值（33.4±3.7 nM）高度一致，而5s进样且包含伪峰时误差增大（K_d=50.1±23.5 nM）。表明小进样量和正确积分策略可提升准确性。

高电导条件下的新定量策略

当传统分离失败时（如PBS样本），研究提出基于"去堆积"组分定量的新方法。模拟表明，分析物迁移率增加（如因结合蛋白质）会促进其逃离样本塞（图5）。实验验证：随凝血酶浓度增加，适配体去堆积面积百分比上升，拟合所得K_d（21.4 nM）与FA（33.4 nM）可比（图6）。该方法成功应用于S10yh2适配体与HSA的结合测定（图7），证实其普适性。

4 结论

本研究系统阐述了高电导样本在CE结合分析中的挑战与解决方案。中等电导差异下，优化进样条件和积分方法可改善准确性；高电导差异时，"去堆积"定量策略提供了可靠替代方案。工作为在生理缓冲条件下精准量化生物分子相互作用提供了实践指南，拓展了CE在生物分析中的应用潜力。

作者贡献与资助

Miyuru De Silva负责概念化、实验和论文撰写；Samson Aruna和Bhagya Samarakoon参与实验；Rebecca J. Whelan指导研究并资助。研究受NIH（NIGMS、OD、NCI）和堪萨斯大学支持。无利益冲突声明。