南极细菌源PsyOmp38蛋白的抗生物被膜新机制：从分子结构到治疗应用

本文推荐了来自南极细菌Psychrobacter sp. TAE2020的PsyOmp38蛋白在抗生物被膜（Biofilm）研究中的突破性发现。该蛋白能有效抑制表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）的黏附、生物被膜形成并瓦解成熟被膜，与万古霉素（vancomycin）联用可显著降低其最小生物被膜清除浓度（MBEC）。研究还展示了该蛋白在医用硅材料（PDMS）表面功能化中的应用潜力，为开发新型抗感染策略提供了重要依据。

　　

1 引言

生物被膜（Biofilm）是由微生物群体及其分泌的胞外聚合物（EPS）构成的动态聚集体，能够增强营养捕获并提供物理保护，使被膜内细菌对抗菌药物的耐药性提高10-1000倍，成为全球抗菌耐药危机的重要推手。针对生物被膜的多阶段形成过程——黏附、成熟和分散，开发可干扰任一阶段的抗生物被膜分子已成为研究热点。

极端环境如南极蕴藏着丰富的微生物资源，其分泌的抗生物被膜分子可能赋予它们在贫营养环境中的生存竞争优势。来自南极海洋细菌Psychrobacter sp. TAE2020的蛋白-多糖复合物CATASAN已被证明可干扰表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）生物被膜发展的各个阶段。本研究聚焦于该复合物的蛋白质组分——PsyOmp38，旨在阐明其结构和功能特性，探索其在抗生物被膜治疗和材料工程中的应用潜力。

2 材料与方法

2.1 菌株、培养基与质粒

实验所用Psychrobacter sp. TAE2020在15°C的Gut合成培养基中培养；S. epidermidis O-47和RP62A于37°C BHI培养基中培养；大肠杆菌（Escherichia coli）Top10用于克隆，BL21(DE3)和C41(DE3)用于重组蛋白表达。

2.2 表达质粒构建与蛋白生产

通过PCR扩增获得含信号肽（Omp38+SP）与不含信号肽（Omp38-SP）的基因片段，克隆至pET28a载体，转化至E. coli BL21(DE3)进行诱导表达。表达条件经优化：Omp38+SP使用1 mM IPTG在20°C诱导24小时；Omp38-SP使用2 mM IPTG在25°C诱导6小时。

2.3 包涵体变复性与蛋白纯化

两种重组蛋白主要存在于包涵体中，采用尿素变性-透析复性方法回收蛋白，并通过阴离子交换层析进行纯化。蛋白质经SDS-PAGE和尿素-PAGE（UREA-PAGE）分析，质谱鉴定确认蛋白身份。

2.4 抗生物被膜活性评估

通过结晶紫染色法评估蛋白对生物被膜形成及成熟被膜的解离作用；采用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）结合LIVE/DEAD染色分析被膜结构变化，使用COMSTAT软件量化生物被膜生物量、平均厚度和粗糙度系数（Ra*）。

2.5 乳化活性与生物相容性

乳化指数（E₂₄）测定评估蛋白乳化能力；MTT法检测蛋白对人永生化角质形成细胞（HaCaT）和小鼠成纤维细胞（BALB/c-3T3）的细胞毒性。

2.6 协同抗菌与材料表面功能化

采用棋盘格法评估PsyOmp38与万古霉素联用对成熟被膜的清除效果；通过接触角测量和流动腔系统分析蛋白涂层对PDMS材料表面性质及抗生物被膜效能的影响。

2.7 生物信息学分析

通过BLASTP、多序列比对（Clustal Omega）、系统进化树构建（Jalview）和AlphaFold2结构预测，分析PsyOmp38的序列和结构特征。

3 结果

3.1 蛋白表达、纯化与初步功能

两种重组蛋白均成功表达并复性，纯化后在SDS-PAGE中呈现双带现象，质谱证实为同一蛋白。复性后的蛋白能够有效抑制S. epidermidis的初始黏附、生物被膜形成，并促进成熟被膜解离。

3.2 抗生物被膜活性

纯化蛋白在低浓度（1 μg/mL）下即可抑制被膜形成，3 μg/mL以上浓度可瓦解24小时成熟被膜。CLSM显示，经蛋白处理后，被膜生物量和厚度显著降低，粗糙度增加，表明被膜结构变得疏松和不规则。

3.3 乳化活性与生物相容性

PsyOmp38具有浓度依赖的乳化活性，但效率低于CATASAN复合物。细胞毒性实验显示，该蛋白在72小时处理下对HaCaT和BALB/c-3T3细胞的半抑制浓度（IC₅₀）分别为42 μg/mL和81 μg/mL，低于其有效抗被膜浓度，具有良好的生物相容性。

3.4 与万古霉素的协同作用

PsyOmp38（100 μg/mL）与万古霉素联用可使后者的最小生物被膜清除浓度（MBEC）从60 μg/mL降至15 μg/mL，显著增强其抗菌效能。

3.5 PDMS涂层抗被膜性能

PsyOmp38涂层使PDMS表面接触角从80°降至45°，亲水性增强。流动腔实验表明，涂层表面能够有效减少S. epidermidis生物被膜的形成，但涂层均匀性有待优化。

3.6 结构特性分析

系统进化分析将PsyOmp38归类为一个新的外膜蛋白家族，其结构与Acinetobacter OmpA和Pseudomonas OprF具有同源性。该蛋白具有N端跨膜β-桶状结构、C端肽聚糖结合域及连接区。关键疏水区域和肽聚糖结合位点的氨基酸变异可能影响其乳化及生物被膜干扰活性。

4 讨论

本研究证实PsyOmp38单独具备显著的抗生物被膜活性，其机制可能涉及改变表面疏水性、乳化作用以及对被膜基质的物理干扰。该蛋白与万古霉素的协同作用为临床治疗提供了新思路。此外，其在PDMS表面的成功涂层展示了其在医疗器械抗感染涂层中的应用前景。

生物信息学分析揭示PsyOmp38代表一个新的外膜蛋白亚家族，其结构特征为理解其功能多样性提供了分子基础。今后的研究应聚焦于其与被膜基质成分的具体相互作用机制及涂层技术的优化。

5 结论

PsyOmp38作为一种新型抗生物被膜蛋白，不仅具有抑制细菌黏附、生物被膜形成与解离成熟被膜的多重功能，还可与抗生素协同增效并用于生物材料表面功能化。这些发现为开发针对生物被膜相关感染的治疗策略和功能性材料提供了重要实验依据和理论支持。