高温通过削弱CsWRKY76-CsPR4A模块免疫功能促进柑橘黄斑病毒在甜橙中积累的分子机制

本研究揭示了高温通过抑制柑橘免疫关键调控模块CsWRKY76-CsPR4A的表达，显著促进柑橘黄斑病毒（CYMV）积累的分子机制。研究发现37°C高温环境下，转录因子CsWRKY76及其调控的病程相关基因CsPR4A表达显著下调，通过酵母单杂交和双荧光素酶实验证实CsWRKY76直接结合CsPR4A启动子并激活其转录。基因沉默实验表明沉默任一基因均导致病毒积累增加，而过表达则增强抗性。该研究为开发高温抗病柑橘品种提供了重要理论依据和分子靶点。

　　

高温促进柑橘黄斑病毒积累的机制研究

引言背景

全球气温升高加剧了作物病害的严重程度，对农业生产构成重大威胁。柑橘黄斑病毒（Citrus yellow mosaic virus, CYMV）作为坏疽病毒属的双链DNA病毒，是严重危害世界最大水果产业——柑橘生产的主要病原体之一。近年来极端高温天气对植物生长发育产生不利影响，同时高温环境还会加速病毒复制和媒介活动，加剧植物病毒的传播。研究表明环境温度与植物-病毒相互作用存在双向关系，既影响病毒感染也调节植物防御机制。植物在相对低温（10°C–23°C）下启动效应器触发免疫（ETI）信号，而在中度高温（23°C–32°C）下则转向模式触发免疫（PTI）信号。当植物同时面临高温和病原体胁迫时，会优先增强耐热性而非病原抗性，导致高温环境下植物免疫反应暂时减弱，更易感病原侵染。

高温促进CYMV积累的现象验证

研究首先通过为期一年的观察发现，在重庆地区温室栽培的Madam Vinous甜橙中，CYMV在老叶组织中的含量最高，其次为老树皮、根和幼树皮，幼叶中病毒含量最低。病毒接种2年后，在老叶上持续观察到叶片症状，而新梢幼叶未见症状。

温度记录显示，从2022年7月到2023年6月期间，甜橙老叶中相对CYMV含量从7月到9月呈上升趋势，10月到1月显著下降，次年2月起又逐月上升。病毒含量变化趋势与重庆地区温室温度变化趋势基本一致，初步表明CYMV含量与环境温度密切相关。

为排除季节变化中其他环境变量（如湿度和光照）的干扰，研究采用植物培养箱控制温度变量。比较25°C和37°C条件下CYMV阳性甜橙的病毒积累情况，发现37°C高温处理的植株病毒滴度显著高于25°C条件。接种后0、7、14、21和30天的检测结果显示，37°C生长的甜橙中CYMV含量显著高于25°C植株，表明高温促进了CYMV的积累。

转录组分析揭示防御基因下调

为深入研究高温、病毒和甜橙寄主间的相互作用，研究对25°C和37°C条件下感染CYMV的甜橙老叶进行转录组测序。差异表达基因分析显示，25°C处理组与37°C处理组间共鉴定到2747个差异表达基因，其中1770个基因上调，977个基因下调。

GO富集分析显示，显著上调和下调的DEGs中排名前30的GO术语包括"序列特异性DNA结合"、"碳水化合物结合"、"转运蛋白活性"、"转移酶活性，转移己糖基基团"、"跨膜转运蛋白活性"和"氧化还原酶活性"。

KEGG富集分析表明，不同温度下CYMV感染甜橙的DEGs主要与植物先天免疫防御和胁迫抗性机制相关通路有关。与37°C相比，25°C下CYMV感染的甜橙中有更多植物免疫相关DEGs过表达，如"苯丙烷生物合成"、"植物-病原互作"、"氨基糖和核苷酸糖代谢"、"马达蛋白"和"MAPK信号"通路。而与生长发育相关的DEGs子集，包括"光合作用-天线蛋白"、"植物激素信号转导"、"托烷、哌啶和吡啶生物碱生物合成"、"植物昼夜节律"、"内质网中的蛋白质加工"和"色氨酸代谢"，在25°C下表达减少。

RT-qPCR结果证实，37°C下甜橙中响应热胁迫的基因如热休克蛋白HSP17.4A和HSP21表达上调，而抗病相关基因如Cht4、WRKY76、PR4A和COMT1的表达显著抑制。基于WRKY和病程相关（PR）家族基因与植物抗病机制的已有证据，研究选择CsWRKY76和CsPR4A作为后续研究的主要靶点。

CsWRKY76正调控CsPR4A表达的分子机制

RT-qPCR检测发现CsWRKY76和CsPR4A在37°C下的表达显著抑制。荧光显微镜观察显示CsWRKY76-GFP定位于细胞核，CsPR4A-GFP定位于细胞膜，而空载体转化的表皮细胞中荧光信号遍布全细胞。

通过Alphafold3对CsWRKY76与proCsPR4A启动子DNA片段复合物进行计算机建模，PyMOL v. 2.5.4进一步分析互作细节。预测显示CsWRKY76的104-136位氨基酸与proCsPR4A DNA片段的50-56位核苷酸相互作用；CsWRKY76与proCsPR4A的结合自由能为-11.6 kcal·mol^-1，表明两者存在稳定相互作用。

将CsWRKY76的CDS和CsPR4A的启动子片段分别克隆到pGADT7激活域（AD）和pAbAi载体中，转入酵母细胞进行酵母单杂交（Y1H）实验。结果显示，只有共转化pGADT7-CsWRKY76和含有CsPR4A启动子区域的pAbAi的酵母细胞能在含有金担子素A（AbA）的选择培养基上存活，表明CsWRKY76与CsPR4A启动子相互作用。

将CsWRKY76的CDS和CsPR4A的启动子片段分别克隆到pGreenII 62-SK和pGreenII 0800-Luc载体中，注射本氏烟草叶片进行双荧光素酶报告实验。结果证实，与对照组合相比，共表达proCsPR4A-LUC和35S:CsWRKY76显著提高了本氏烟草叶片中的荧光素酶活性。这些结果表明CsWRKY76能在植物体内与proCsPR4A结合并激活CsPR4A表达。

基因沉默促进CYMV积累

为研究CsWRKY76和CsPR4A在防御CYMV感染中的功能，研究利用病毒诱导基因沉默（VIGS）技术在"锦橙"甜橙植株中沉默这两个基因。通过RT-qPCR测定沉默植株中CsWRKY76和CsPR4A的转录水平。

将CYMV感染性克隆通过注射接种到沉默植株中，分别在接种后30、60和90天取样，通过RT-qPCR检测CYMV。发现CsWRKY76沉默植株相比对照植株叶片黄化症状显著加重，CsPR4A沉默植株虽未表现明显褪绿症状，但两者CYMV外壳蛋白基因（CP）含量均显著高于对照植株。

到60天时，所有接种CYMV的植株都表现出叶片黄化症状，而CsWRKY76和CsPR4A沉默植株的叶脉更加清晰。CsWRKY76沉默植株中CYMV含量是对照组的10,000倍以上，CsPR4A沉默植株中CYMV CP含量是对照组的5,000倍以上。到90天时，所有植株仍保持叶片黄化表型，CsWRKY76和CsPR4A沉默植株及对照组中仍保持相当量的CYMV CP含量，但与60天时相比呈下降趋势。这些发现表明沉默CsWRKY76和CsPR4A显著促进了CYMV的积累。

CsWRKY76和CsPR4A正调控柑橘对CYMV的抗性

为进一步阐明CsWRKY76和CsPR4A在CYMV感染中的作用，研究构建了CsWRKY76和CsPR4A过表达（OE-CsWRKY76和OE-CsPR4A）及RNA干扰（RNAi-CsWRKY76和RNAi-CsPR4A）毛状根。通过组织化学检测β-葡萄糖醛酸苷酶（GUS）活性和PCR验证转化毛状根。

通过嫁接使阳性表达的转化毛状根感染CYMV。过表达CsWRKY76和CsPR4A的根对CYMV CP积累有抑制作用，而RNAi-CsWRKY76和RNAi-CsPR4A根中的CYMV数量相比对照组显著增加，与VIGS实验结果一致。表明CsWRKY76和CsPR4A都是柑橘免疫的正调控因子。

过表达CsWRKY76的根中过氧化氢（H₂O₂）含量增加，而RNAi-CsWRKY76根中减少。RT-qPCR实验显示，OE-CsWRKY76根中参与H₂O₂降解的POD和CAT表达水平降低，而参与苯丙烷代谢途径的PAL2和COMT1表达水平上调。H₂O₂的增加能有效抑制病毒增殖。

讨论与展望

全球变暖被认为是人类当前面临的最重大环境挑战之一，过高温度对作物正常生理生长产生不利影响。不同温度条件下病毒含量的变化与病毒的生物学特性、环境影响和寄主因素密切相关。温度不仅影响病毒的存活和传播能力，还影响寄主的免疫和生理代谢。

CYMV对一些国家的柑橘产业产生了严重危害。基于中国重庆北碚自然气候的详细记录，温度升高有利于CYMV增殖。为在季节变化中控制其他环境变量，研究使用植物培养箱分离温度作为唯一变量。37°C下甜橙中CYMV含量在一周内增加近15倍，并在随后一个月保持较高水平，表明高温是促进CYMV积累的主要驱动因素。

与分析高温如何促进CYMV在甜橙中积累相比，研究更关注甜橙如何在高温条件下抵抗CYMV感染。通过对25°C和37°C条件下CYMV感染甜橙的转录组数据比较分析发现，37°C下与植物病原抗性相关的基因，如MAPK信号（17个DEGs）和苯丙烷生物合成（23个DEGs）被下调。MAPKs磷酸化多种底物，包括转录因子、蛋白激酶和细胞骨架相关蛋白，从而激活下游防御反应相关基因的表达。苯丙烷生物合成负责合成植物抗逆次级代谢产物（如黄酮类和木质素），其下调进一步表明37°C下甜橙表现出抗逆产物合成减弱，无法有效抵抗CYMV感染。

研究在OE-CsWRKY76转基因毛状根中检测到苯丙烷代谢途径基因显著上调，证明苯丙烷生物合成途径对甜橙抵抗CYMV感染具有关键贡献。相比之下，参与光合作用-天线蛋白和昼夜节律的基因被下调。植物光感和温度感应通路中存在共同信号组分，推测甜橙激活了感知高温的信号通路，使植株增强对高温胁迫的耐受性。

值得注意的是，37°C下色氨酸代谢通路中8个DEGs上调，11个DEGs下调。色氨酸代谢产生吲哚乙酸（IAA，生长素）和褪黑素等产物。IAA对植物生长发育至关重要，但与水杨酸（SA）在维持病原防御和生长过程间的动态平衡中发挥拮抗作用。病原入侵时，SA的积累优先通过抑制IAA信号通路激活抗病原反应。37°C下，甜橙中SA介导的抗病通路明显被CYMV破坏，可能因此上调色氨酸代谢通路（与生长素合成相关）基因。另一种可能是37°C下上调的DEGs主要负责褪黑素生物合成。在非生物胁迫下，褪黑素通过增强合成和减少降解来提高叶绿素水平，维持光合功能。褪黑素还通过稳定光系统I和防止光系统II分解来保护光系统，从而在恶劣环境中确保能量供应。

响应高温胁迫时，植物优先上调热休克蛋白（HSPs）以维持蛋白质稳态。这种现象在热敏感和PVY易感马铃薯品种以及耐热和PVY抗性马铃薯品种中均有观察到。然而在耐热和PVY抗性马铃薯品种中，大量PR蛋白被同时诱导，这可能是其抵抗PVY的主要机制。鉴于在热胁迫环境中需要减轻CYMV感染，阐明热休克蛋白（HSPs）的作用变得十分必要。

WRKY家族转录因子参与大多数植物生长发育过程，并协调植物对生物胁迫的响应。例如，来自美国葡萄Vitis rupestris的VrWRKY22通过增强微管介导的信号通路提高悬浮细胞系对Neofusicoccum parvum的抗性。病原诱导的SA合成主要依赖于叶绿体中异分支酸合酶（ICS）的激活，这种调控机制涉及多个转录因子，如WRKY28和WRKY75，而NRP1被鉴定为SA的特异性受体。NRP1的N端BTB/POZ结构域促进其与SA结合，后续研究揭示NRP1也以单体形式与TGA转录因子结合，从而激活下游PR基因的表达。

本研究中，CsWRKY76和CsPR4A在温度介导的病毒感染中表达大幅下降。VIGS技术和农杆菌介导的转基因实验充分证明CsWRKY76和CsPR4A对柑橘抵抗CYMV具有正调控功能。通过双荧光素酶和Y1H实验证实了CsWRKY76直接结合CsPR4A启动子并正调控其表达的分子机制。因此，CsWRKY76-CsPR4A调控在柑橘-CYMV互作中起关键作用。此外，在甜橙中过表达CsWRKY76诱导了H₂O₂水平 concomitant 上升和苯丙烷途径基因表达上调。从这些结果推断，存在一种特定机制在37°C下抑制CsWRKY76表达，从而抑制与CsWRKY76相关的下游免疫激活。在适宜的甜橙栽培环境中，CsWRKY76进一步激活CsPR4A，这一过程作为抵抗CYMV感染的关键调控机制。

实验方法

研究采用7年生CYMV毒性和健康Madam Vinous甜橙植株，保存在中国重庆北碚柑橘研究所温室中，温度控制在24°C–26°C。通过嫁接促进这些树的CYMV感染，随后通过PCR确认感染。本研究将主干下部（无分枝）的树皮称为老树皮。从主干向上生长枝条基部附近的前三片叶指定为老叶。柑橘树主枝上的三片顶端叶分类为幼叶，而这些叶附近的树皮称为幼树皮。从表现出侧根的主根随机收集根样品。所有样品用手术刀或剪刀解剖，取样后用双蒸水短暂冲洗并立即冷冻在液氮中。"锦橙"甜橙提取的种子用于VIGS测定。本氏烟草植株在25°C植物培养箱中培养，光暗周期16小时:8小时。

总DNA使用FastPure Plant DNA Isolation Mini Kit（Vazyme）提取。总RNA使用RNAiso Plus（总RNA提取试剂；Takara）提取。使用NanoDrop 2000分光光度计（Thermo Scientific）测定总DNA和RNA的浓度和纯度。根据PrimeScript II第一链cDNA合成试剂盒（Takara）用户指南进行cDNA合成。

使用SYBR qPCR SuperMix Plus（Takara）进行qPCR。在CFX96TM实时系统（Bio-Rad）上设置以下热循环参数：95°C初始保持1分钟；随后45个循环的95°C 20秒，58°C 20秒和72°C 30秒；随后65°C到95°C熔解曲线程序，每5秒逐渐升高0.5°C。使用2^?ΔΔCt方法进行分析，COX用作内参基因。每个基因设置三个技术重复，进行两个生物学重复。

为研究CYMV含量的年度变化，将CYMV感染的Madam Vinous甜橙植株培养在中国重庆北碚柑橘研究所的防虫网室中。防虫网室内外温差几乎相同。北碚每日温度数据从中国气象局获取。为进一步探索温度对CYMV积累的影响，使用CYMV感染的Madam Vinous甜橙植株进行受控实验。植株保持在植物培养箱中。建立两个温度组：对照组保持在25°C，高温组在37°C。两组都遵循14小时光照/10小时黑暗循环，整个实验期间相对湿度保持在75%。

从第4.3节中选择六株CYMV感染的Madam Vinous甜橙植株；三株保持在25°C（植株CY-1、CY-2和CY-3），三株在37°C（CY-4、CY-5和CY-6）1个月。随后，每株随机收集的三片老叶混合后送北京诺禾致源科技股份有限公司进行RNA测序。使用Bowtie v. 2过滤原始测序数据。使用HISAT v. 2.0.5将清洁读数映射到甜橙参考基因组。使用featureCounts软件估计每个样本中基因的转录水平。使用edgeR识别DEGs，过滤阈值FDR < 0.05和log₂foldchange > |1|。基于GO数据库或KEGG数据库进行基因功能注释。使用Enrichr计算GO和KEGG富集分析。

通过RT-PCR从Madam Vinous甜橙克隆CsWRKY76和CsPR4A的CDS。相关引物见表S2。基于Alphafold3预测CsWRKY76转录因子与CsPR4A启动子DNA片段的结合。使用PDBePISA工具分析蛋白质-DNA相互作用。使用PyMOL v. 2.5.4软件定义相互作用细节，从而生成三维相互作用表示。使用SGN VIGS工具设计基因沉默片段。

将CsWRKY76和CsPR4A的CDS（均无终止密码子）克隆到pCV-GFP载体中，生成两种融合蛋白：CsWRKY76-GFP和CsPR4A-GFP。相关引物见表S2。空pCV-GFP载体用作对照。然后将载体单独转化到根癌农杆菌GV3101（伟帝生物技术）中。携带载体构建体的根癌农杆菌用于农业浸润4周龄本氏烟草植株，如先前所述。在此过程三天后，在25°C温度下，使用倒置荧光显微镜（IX-73；奥林巴斯）观察转化叶组织中的荧光信号。DAPI荧光激发光波长为405纳米，GFP为488纳米。

使用基于柑橘叶斑病毒（CLBV）的系统在锦橙甜橙植株中沉默检查的基因。扩增CsWRKY76（28–328 bp）和CsPR4A（1–300 bp）的部分CDS片段并插入pCLBV201载体中。相关引物见表S2。将载体分别转化到根癌农杆菌GV3101中。根癌菌在含有适当抗生素的5毫升LB培养基中培养至OD600为0.8–1.2。随后，将上一步的2毫升细菌培养物接种到200毫升新鲜LB培养基中。然后将细菌溶液转移到28°C 220 rpm的摇床中振荡过夜以达到OD600 = 0.8。然后在4°C 6000 rpm下离心增殖液5–10分钟。将沉淀的细菌用细菌悬浮液稀释至OD600为0.6–0.8，随后样品在黑暗中静置3小时。随后，大约30株锦橙甜橙组培苗在0.1 MPa下真空浸润60秒，如所述。然后用滤纸从幼苗表面去除多余细菌悬浮液。将幼苗移植到Murashige和Skoog液体培养基中，随后在黑暗中处理2小时。最后将幼苗移植到土壤中。然后将植株培养在光照培养箱中，通过PCR确认植株转化。

根据Xiao等人所述进行根介导的遗传转化方法。为构建过表达载体，将CsWRKY76和CsPR4A的全长CDS克隆到含有β-葡萄糖醛酸苷酶（GUS）基因的pLGN-OE载体中。空pLGN-OE载体用作对照。扩增CsWRKY76（28–328 bp）和CsPR4A（1–300 bp）的部分CDS片段并插入含有GUS基因的pLGN-RNAi载体中以构建干扰载体。相关引物见表S2。将载体分别转化到发根农杆菌K599中。根癌菌在含有适当抗生素的5毫升LB培养基中培养至OD600为0.6–0.8。随后，将上一步的2毫升细菌培养物接种到200毫升新鲜LB培养基中。然后将细菌溶液转移到28°C 200 rpm的摇床中振荡过夜以达到OD600 = 0.6。然后在24°C 5000 rpm下离心增殖液5分钟。将沉淀的细菌用细菌悬浮液稀释至OD600为0.4–0.6，随后样品在黑暗中静置2–4小时。随后，从温室收集嫩Madam Vinous甜橙枝条（深绿色），切成10–12厘米段，下端浸入细菌悬浮液中。然后在0.1 MPa下真空浸润30分钟。最后将枝条段培养在高湿度培养基（土壤和沙子3:1体积混合物）中，盆栽尺寸25.5 × 26.5 × 30.0厘米。段在25°C下生长，光周期16小时/8小时昼夜。然后使用GUS染色试剂盒（SL7160；Coolaber）按照制造商协议进行Madam Vinous甜橙瞬时表达的组织化学检测GUS活性。使用过氧化氢测定试剂盒（Solarbio）测定H₂O₂水平。

克隆CsPR4A启动子序列并插入pAbAi载体中，随后用BstBI（NEB）消化。将线性化质粒随后转化到Y1H Gold酵母细胞中作为诱饵。然后将猎物质粒pGADT7-CsWRKY76转化到诱饵菌株中。将pAbAi-p53和pGADT7-p53载体转化到酵母菌株中作为阳性对照。相关引物见表S2。将pAbAi-proCsPR4A和空pGADT7载体转化到酵母菌株中作为阴性对照。选择单菌落并在含有适当浓度金担子素A（AbA）的SD/?Leu培养基上培养以确认阳性相互作用。

将CsWRKY76的CDS插入pGreenII 62-SK载体中作为效应器质粒，将CsPR4A的启动子序列插入pGreenII 0800-LUC载体中作为报告质粒。相关引物见表S2。通过冻融法转化根癌农杆菌GV3101，并使用PCR确认阳性克隆（pGreenII 62-SK-CsWRKY76 + pGreenII 0800-LUC-proCsPR4A）。使用以下组合：pGreenII 62-SK + pGreenII 0800-LUC proCsPR4A、pGreenII 62-SK-CsWRKY76 + pGreenII 0800-LUC和pGreenII 62-SK + pGreenII 0800-LUC。随后，以效应器质粒与报告质粒体积比9:1将悬浮液注射到本氏烟草叶片中。3天后，按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒手册（Yeasen）说明对本氏烟草叶片进行进一步分析。将荧光素酶底物D-荧光素钾盐以0.3毫克/毫升浓度施于注射本氏烟草叶片的背面。随后将叶片置于黑暗中20分钟，并使用植物活体成像系统（CCD）（Lumazone Pylon 2048B成像系统）成像。

使用GraphPad Prism软件v. 10.3.0进行统计分析和绘图软件。对于成对比较，通过Student t检验计算显著性分析。为进行多组比较，通过单因素或双因素ANOVA计算显著性分析。使用星号表示显著差异（ns p ≥ 0.05，p < 0.05，p < 0.01，p < 0.001，p < 0.0001）。