山梨醇诱导巴贝西虫同步化及亚油酸对寄生虫源囊泡影响的评估：探索胞外囊泡分泌调控新策略

本研究探讨了山梨醇诱导巴贝西虫（Babesia duncani）体外同步化的可行性，并评估了亚油酸（LA）对寄生虫胞外囊泡（EVs）分泌的潜在抑制作用。通过纳米粒子追踪分析（NTA）和扫描电镜（SEM）技术，研究发现LA虽未显著改变红细胞形态或直接降低EVs浓度，但可能通过抑制丝状体（FF）发育阶段间接影响EVs分泌，为探索巴贝西虫病治疗新靶点提供了重要依据。

　　

引言

人类巴贝西虫病是一种由顶复门原虫巴贝西虫（Babesia）引起的血液传播寄生虫病，主要致病种为Babesia microti和Babesia duncani。该寄生虫通过蜱虫叮咬传播，感染宿主红细胞（RBC），引起从流感样症状到器官衰竭的临床表现。B. duncani的细胞内发育阶段包括早期环状体（ER）、成熟环状体（MR）、丝状体（FF）、年轻四联体（YT）和成熟四联体（MT），其中FF阶段是胞外囊泡（EVs）分泌的关键期。

EVs包括外泌体（50-100 nm）、凋亡小体（1000-5000 nm）和微囊泡（MVs）（50-1000 nm），在病原体-宿主相互作用中扮演重要角色。研究表明，巴贝西虫分泌的EVs携带microRNAs等生物分子，可能通过调节免疫反应影响疾病进展。亚油酸（LA）作为一种多不饱和脂肪酸，在利什曼原虫和疟原虫研究中已显示抑制EVs分泌的潜力，其机制可能与改变膜流动性有关。

材料与方法

寄生虫培养与同步化

采用B. duncani WA-1株（耶鲁大学Choukri Ben Mamoun博士惠赠）在5%血细胞比容的人O型血中进行体外培养。培养基包含Claycomb培养基、20%热灭活胎牛血清（FBS）及各种添加剂，在37°C、2% O₂/5% CO₂/93% N₂条件下培养。

为建立同步化培养体系，测试了0.001%-5%浓度范围的山梨醇处理方案。通过吉姆萨染色血涂片显微镜观察，评估不同浓度和时间点（0/24/48小时）的环状体同步化效率。基于疟原虫研究基础，优选1%山梨醇10分钟处理方案进行后续实验。

LA处理与EVs分析

使用0.1/0.3/0.8 μM浓度LA处理培养体系，通过血涂片量化寄生虫血症和FF发育情况。EVs分离采用多级离心方案：200g/20分钟去除细胞，500g/30分钟清除碎片，最后16,000g/45分钟结合120,200g/16小时超速离心获得EVs沉淀。

采用纳米粒子追踪分析（NanoSight NS Pro系统）定量EVs浓度和粒径分布，扫描电镜（Hitachi S-3400N）观察红细胞形态变化，操作电压10.0 kV，样本经戊二醛-锇酸双重固定和临界点干燥处理。

结果

同步化效果评估

浓度梯度实验显示1%山梨醇在48小时处理时可实现>90%环状体同步化，总寄生虫率达10%。短时处理实验表明1%山梨醇10分钟 incubation即可显著提高环状体比例（18%），而5%浓度反而导致同步化效率下降。这表明山梨醇通过渗透压选择机制有效富集早期发育阶段寄生虫，与疟原虫中新渗透途径（NPPs）机制类似。

LA对发育阶段的影响

0.8 μM LA处理48小时后，实验组FF数量减少至对照组的1/3，但总寄生虫率无显著差异。0.1-0.3 μM浓度未呈现明显抑制效应。血涂片显示LA处理组主要保留环状体形态，而对照组可见典型丝状结构，表明LA可能特异性干扰FF发育进程。

EVs特性分析

NTA检测显示分离的EVs主要粒径为73-78 nm（模式尺寸）和98-107 nm（平均尺寸），符合外泌体特征。直接LA处理实验表明：0.8 μM组粒子浓度最高（5.4×10¹¹/mL），对照组最低（4.6×10¹¹/mL），说明LA不能直接破坏已形成的EVs。

超微结构观察

扫描电镜未见LA处理引起的红细胞表面形态学改变，感染组与未感染组红细胞形态保持完整，各发育阶段寄生虫的膜结构未出现显著病理改变，但观察到膜起泡现象增加。

讨论

山梨醇同步化成功证实B. duncani存在与疟原虫类似的膜通透性调控机制，1%浓度10分钟处理方案为后续研究提供标准化同步方案。LA对FF阶段的特异性抑制提示其可能通过改变脂质微环境影响寄生虫发育，而非直接杀伤作用。

EVs浓度不变而FF数量减少的现象表明：LA可能作用于囊泡生物合成途径而非分泌过程。膜起泡现象增加与PUFA改变膜流动性理论相符，但具体分子机制需进一步研究。值得注意的是，巴贝西虫与疟原虫的膜转运机制存在差异，前者可能更多依赖脂质重组而非蛋白通道。

本研究为探索脂质代谢干预策略提供了基础，未来需拓展LA浓度梯度、延长观察时间、结合组学技术深入解析其作用靶点，为开发巴贝西虫病新型治疗方案提供理论依据。