T-DNA方向与间距及转化靶细胞对共转化系统中载体骨架整合及无标记转基因植物生成效率的显著影响

本研究系统探讨了双T-DNA载体设计中间隔区长度和T-DNA相对取向对共转化效率及整合模式的影响，发现~3 kb间隔区可有效降低连锁整合风险，而反向排列反而增加紧密整合；研究还揭示了物种间（烟草、番茄、生菜、拟南芥）和转化方法（体细胞与生殖细胞转化）的显著差异，为优化无标记转基因植物（marker-free transgenic plants）开发策略提供了关键设计依据。

　　

摘要

开发无标记转基因植物对于应对生物安全关切和促进监管批准至关重要。共转化策略通过将目的基因（GOI）和选择标记基因（SMG）分别置于两个独立的T-DNA上，为实现无标记转基因提供了一种有效途径，但该策略常受到连锁整合和载体骨架（VB）序列整合的干扰。本研究设计并评估了一系列具有不同间隔序列长度和取向的双T-DNA载体，以确定它们在不同植物物种中共转化效率和整合模式的影响。

引言

遗传转化方法，包括根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的转化和直接基因转移技术，通常依赖选择标记基因（如NPT II）来识别和选择转基因材料。然而，SMG的持续存在引发了生态和生物安全担忧，特别是关于基因向野生种、非转基因作物或病原体水平转移的可能性。此外，SMG可能对植物施加代谢负荷，并限制基因叠加和再转化努力。因此，开发无标记转基因植物对于促进其监管批准和增强商业应用具有重要意义。

共转化是一种将GOI和SMG分别置于两个T-DNA上，随后通过遗传分离获得无标记转基因植物的方法。其成功取决于两个T-DNA独立整合到不连锁的基因组位点，但这本质上效率低于单T-DNA整合。此外，农杆菌介导的转化常常导致超出T-DNA边界的读through，从而发生非预期的载体骨架序列整合，而在双T-DNA系统中，这可能导致两个T-DNA作为一个片段发生连锁整合。

结果

两个T-DNA之间的距离影响连锁整合的可能性

为评估间隔区长度对两个T-DNA作为单个单元整合（连锁整合）的影响，研究人员设计了三种具有不同间隔长度的双T-DNA载体：pRED-AN-MF1（116 nt）、pRED-AN-MF2（1167 nt）和pRED-AN-MF3（3074 nt）。所有载体中，T-DNA1携带GOI（DsRED2），T-DNA2携带SMG（NPT II，赋予卡那霉素抗性）。两个T-DNA大小相似（T-DNA1：2382 nt；T-DNA2：2067 nt）并以串联取向（RB1-LB1-RB2-LB2）排列。

在烟草中的转化结果显示，pRED-AN-MF1的共转化效率（基于RFP荧光）为57%，pRED-AN-MF2为55%，而pRED-AN-MF3最低，为19%。PCR分析发现，pRED-AN-MF1和pRED-AN-MF2转化再生植株中分别有35%和17%携带间隔区，证实发生了连锁整合。相比之下，pRED-AN-MF3的38株测试植株中均未扩增出间隔序列，连锁整合率为0%。这些发现与荧光筛选结果一致，pRED-AN-MF3的200株转化植株均未显示GFP表达（指示间隔区整合）。然而，在一些愈伤组织中观察到了局部的GFP表达斑块。

两个T-DNA的取向影响共转化效率及其整合模式

为了解T-DNA在载体中的相对取向是否影响其共转化和作为单个单元的整合频率，研究人员构建了新载体pRED-AN-MF2-i，其中两个T-DNA以反向排列（LB1-RB1-RB2-LB2），并与间隔长度近乎相同的串联取向载体pRED-AN-MF2（RB1-LB1-RB2-LB2）进行比较。

结果表明，具有反向T-DNA取向（pRED-AN-MF2-i）的转基因烟草枝条，其成功共转化的百分比（43%）低于串联取向的pRED-AN-MF2（55%）。此外，对pRED-AN-MF2-i T0植株间隔区的PCR分析显示，其连锁共整合频率显著更高（47%），远高于pRED-AN-MF2转基因植株中观察到的17%。一些植株还显示出与预期1673 nt大小不一致的较小扩增子，表明单个T-DNA以反向取向紧密整合。

物种特异性的共转化效率和T-DNA整合差异

研究人员在生菜、番茄和拟南芥中评估了两个T-DNA的共转化效率。使用农杆菌菌株LBA4404携带pRED-AN-MF3转化生菜和番茄，而拟南芥的花序浸渍转化使用菌株GV3101。

基于RFP荧光，番茄的共转化效率为13%，生菜为9%，低于烟草中观察到的19%。在任何再生枝条中均未检测到GFP荧光，表明这些品系中可能不存在连锁整合事件。

在拟南芥中，在选择培养基上发芽的158株存活幼苗中，94株显示RFP荧光，表明成功共转化（60%）。其中53株还显示GFP荧光，表明两个T-DNA整合为一个单元（34%）。此外，还观察到其他整合模式，例如仅GFP荧光（~5%，表明整合了T-DNA2和间隔区但未完全整合T-DNA1）以及在选择培养基上未能存活的幼苗中观察到的多种模式（例如，仅RFP，或仅GFP）。这突出了拟南芥中T-DNA整合的多种模式。

相比之下，在烟草、番茄和生菜中仅观察到两种整合模式——仅T-DNA2（GOI?/GFP?/SMG+）和T-DNA1与T-DNA2分开整合（GOI+/GFP?/SMG+）。这种差异可能源于所使用的不同转化方法（体细胞再生 vs. 生殖细胞转化）。

农杆菌菌株显著影响共转化效率，但不影响载体骨架整合

拟南芥中使用pRED-AN-MF3和GV3101菌株后两个T-DNA作为单个单元共转化的高发生率（34%）出乎意料，因为在使用LBA4404菌株的烟草、番茄或生菜中未观察到此类事件。为调查观察到的整合模式差异是否源于所使用的农杆菌菌株，研究人员使用GV3101菌株转化烟草中的pRED-AN-MF3。

结果显示，GV3101菌株的共转化效率（9%）显著低于使用LBA4404菌株时观察到的19%。然而，PCR基因分型证实，尽管共转化效率不同，但均未检测到连锁整合（0%），且在任何分析的转基因枝条中均未检测到GFP表达。这表明农杆菌菌株影响共转化效率，但不会显著影响大的VB整合或连锁整合。

T1代回收到无标记植物

对来自pRED-AN-MF1、pRED-AN-MF2和pRED-AN-MF3转化的烟草T0植株（这些植株对GOI和SMG呈阳性，但对间隔区呈阴性）的T1代进行标记分离分析。

在所有分析的品系中，大多数植株是GOI+/SMG+（43–88%），而GOI?/SMG+（3–33%）、GOI+/SMG?（0–20%）和GOI?/SMG?（0–10%）的比例显著较低。卡方拟合优度检验显示，六个T0品系中的四个其T1后代显著偏离预期的9:3:3:1分离比（假设两个不连锁杂合位点独立分配）。

定量实时PCR（qRT-PCR）分析证实，在GOI阳性且SMG阴性（GOI+/SMG?）的植株中未检测到SMG表达，而在GOI+/SMG+植株中两个基因均表达。这些结果表明，通过PCR和qPCR识别的标记分离品系不携带任何可扩增或具有转录活性的SMG拷贝。

讨论

连锁整合的可能性受载体中T-DNA间距离的影响

本研究证实，T-DNA间较短的距离增加了连锁整合的可能性。共转化效率（基于选择培养基生长、RFP表达和PCR分析）在pRED-AN-MF1中最高，其次是pRED-AN-MF2和pRED-AN-MF3。然而，对间隔区的PCR和测序揭示，许多来自pRED-AN-MF1和pRED-AN-MF2的共转化植株携带两个T-DNA作为一个单元，这使得它们不适合作为无标记候选株。这些发现强调了对间隔区进行基因分型以区分单独和连锁T-DNA整合的重要性，并表明先前报道的高共转化效率可能部分源于非预期的连锁整合。

维持约3 kb的间隔区可优化独立整合。在该区域中加入报告基因可有效识别连锁整合。与先前一些研究不同，本方法能够在T0代早期识别无标记候选株，显著减少了需要进一步分析的植株数量。

一些转基因品系显示出物理上不连锁但紧密整合的T-DNA，导致意外的扩增子大小。值得注意的是，本研究中使用的PCR引物仅设计用于检测串联取向的整合，意味着反向或其他紧密整合事件可能因PCR和引物的局限性而被遗漏。

两个T-DNA的取向影响共转化效率和整合模式

与先前的一些报道相反，本研究结果表明，反向T-DNA取向并未减少连锁整合，反而增加了紧密和物理连锁的插入。T-DNA转移通常被认为是一个从RB开始并在LB终止的定向过程。然而，多项研究表明，DNA转移也可以从LB起始，RB也可以作为DNA转移的终止位点（效率低），并且从两个边界起始在反向取向中也是可能的（尽管频率大大降低）。紧密整合的多个T-DNA以彼此之间的任何取向也有报道。

间隔区的存在表明了多种可能的整合模式。本研究使用的PCR引物位于T-DNA边界至少150 nt之外，这意味着无法检测到通过RB1反向起始通读RB2并在LB2终止，或通过RB2反向起始通读RB1并在LB1终止的连锁共整合。然而，不能排除此类整合在转基因植株中存在的可能性。

物种特异性的共转化效率和T-DNA整合差异

当使用载体pRED-AN-MF3和农杆菌菌株LBA4404评估生菜和番茄中两个T-DNA的共转化效率时，观察到了可变的共转化效率。重要的是，在选择培养基再生的任何枝条中均未观察到GFP荧光，表明间隔区整合缺失。这证实了pRED-AN-MF3载体对于在这些物种中开发无标记转基因植物是理想的。

当使用农杆菌菌株GV3101通过花序浸渍转化将相同载体导入拟南芥时，观察到了几种不同的T-DNA和VB整合模式。相当比例的存活植株表现出RFP和GFP荧光，表明两个T-DNA发生了连锁整合。共鉴定出七种不同的整合模式，表明存在多种可能的整合机制。

与拟南芥相比，生菜、番茄和烟草显示出更少的整合模式，这可能是由于转化方法的差异。在这些物种中，只有携带SMG的植株在选择培养基中存活，限制了观察到的整合模式的多样性。

在烟草中使用载体pRED-AN-MF1和pRED-AN-MF2的转化实验证明，当间隔区相对较短时，会发生LB读through，导致两个T-DNA的连锁共整合。结合pRED-AN-MF3在烟草、生菜和番茄中的转化结果，这表明影响转化的特定因素——如外植体类型、农杆菌菌株和再生过程——不利于大VB序列的整合或从LB起始。因此，这两个T-DNA在这些物种中更可能单独整合。

转化靶细胞影响载体骨架整合

与在烟草、生菜和番茄中使用相同质粒的转化相比，在使用pRED-AN-MF3转化拟南芥后，观察到连锁整合和VB整合的发生率更高。为了评估农杆菌菌株是否影响结果，研究人员尝试使用菌株LBA4404转化拟南芥，但未回收到转基因幼苗，这与先前关于LBA4404在拟南芥中转化效率显著低于菌株GV3101的报告一致。

对烟草的转化比较表明，虽然农杆菌菌株影响共转化效率，但它并不显著影响大的VB整合或连锁整合。类似发现也在其他比较研究中被报道。VB整合率在两个物种间差异显著，尽管使用相同的菌株（GV3101）和质粒复制起点。这些发现连同本研究的结果表明，VB整合受到农杆菌菌株和质粒复制起点之外因素的影响。

烟草、番茄、生菜和拟南芥转化之间的一个关键区别在于靶向转化的细胞类型。在烟草、番茄和生菜中，转化发生在体细胞中，转基因植株通过从头芽器官发生再生。相反，拟南芥花序浸渍转化主要靶向生殖细胞。据报道，在体细胞中T-DNA整合几个阶段所必需的宿主因子（包括将T-链复制成双链DNA以及将T-DNA分子非法重组到双链断裂中）与生殖细胞中所需的因子不同。考虑到参与DNA代谢的某些基因产物被认为在生殖细胞中比在体细胞组织中更丰富，可能存在特定的T-DNA复制过程，导致拷贝数和整合模式的变化。

此外，T-DNA整合到植物基因组中受到宿主细胞表观遗传景观的影响。生殖细胞和体细胞表现出显著不同的染色质结构——生殖细胞在配子发生过程中经历动态重编程以重置表观遗传标记，而体细胞维持更稳定的染色质以保持其分化状态。细胞类型间染色质可及性的这些变化可显著影响T-DNA整合模式。高通量研究进一步证明，染色质背景在整合效率和整合位点选择中都起着关键作用。

本研究结果表明，体细胞的转化限制了大VB整合，而生殖细胞的转化增强了它们。值得注意的是，在所有三个物种的一些生长愈伤组织中观察到GFP荧光，表明发生了VB整合。这进一步支持了参与DNA复制和细胞分裂的植物因子可能在VB整合中起作用的想法。

T1代回收的无标记植物数量低于预期

尽管选择了间隔区PCR阴性的T0植株，但相当比例的T1植株仍然携带GOI和SMG。先前在拟南芥中的研究表明，多个T-DNA可以整合到相同的基因组位点，通常以直接、头对头或尾对尾取向，导致它们连锁遗传。DNA整合位点被认为是额外T-DNA插入的“热点”，这一观点在大麦研究中得到支持，其中发现多个T-DNA优先整合在BARE-1逆转录转座子的特定区域内。在拟南芥中，也有报道称存在有利于T-DNA整合到AT丰富区域的序列水平偏好。值得注意的是，即使两个T-DNA通过不同农杆菌菌株上的单独质粒递送，也观察到在相同位点整合的类似趋势，表明物理连锁可以独立于递送方法发生。

这种在附近基因组位置的连锁共整合——可能在所用PCR引物无法检测的距离或取向上——可以解释保留GOI和SMG的T1植株数量意外高的原因。为了提高在T0代选择潜在无标记植物的效率，未来的方法可以包括使用更灵敏的长程PCR，旨在检测不同取向的多个T-DNA插入。

结论

本研究强调了间隔长度和T-DNA取向在使用双T-DNA载体生成无标记转基因植物时对共转化效率和整合模式的关键影响。研究结果表明，T-DNA间较短的间隔区域显著增加连锁整合风险，而约3 kb的间隔序列可有效降低此风险。与先前报道相反，反向T-DNA取向并未减少连锁整合，反而增加了紧密间隔和物理连锁的插入。此外，转化结果因植物物种而异，并且发现VB整合受到农杆菌菌株以外因素的影响。研究结果指出了转化靶细胞在VB整合中的潜在影响。在间隔区域内包含报告基因被证明是早期识别T0植株中连锁T-DNA整合事件的重要工具，从而简化了无标记品系的回收。总的来说，研究结果强调了载体设计和转化策略对于高效、精确生成无标记转基因植物的重要性。