全球商品榛子中种子携带的Spirosoma pollinicola：微生物定植与过敏原多样性的综合研究及其对过敏反应的潜在影响

本综述深入探讨了全球商品榛子中内共生菌Spirosoma pollinicola的普遍存在及其与榛子过敏原多样性的关联。研究通过比较蛋白质组学揭示了不同产地榛子过敏原（如Cor a 9和Cor a 14）的丰度差异，并发现其与患者免疫反应显著相关。该研究为通过遗传改良降低榛子致敏性提供了关键靶点，并强调了微生物组在食物过敏中的潜在作用。

　　

摘要

严重的过敏反应在全球范围内呈上升趋势，其中榛子过敏导致的致命性过敏反应已成为重要的公共卫生问题。榛子作为许多食品的常见成分，含有多种可引发严重过敏反应的蛋白质。来自全球主要商业种植区的榛子均检出Spirosoma pollinicola的蛋白质，这种产生内毒素的细菌与榛子花粉的致敏性相关。研究团队无法通过清洗去除S. pollinicola蛋白质污染，表明该细菌是种子内共生菌。比较蛋白质组学分析显示，不同来源榛子的过敏原蛋白组成存在显著差异，且与患者免疫反应相关。特别是来源17和18的榛子中关键抗原Cor a 9和Cor a 14水平较低，表明它们可作为通过遗传改造降低致敏性的候选材料。此外，Spirosoma蛋白质的持久性可能影响榛子的致敏性和患者的免疫反应。

1 引言

食物过敏是一个持续存在且潜在威胁生命的健康问题。近几十年来，食物过敏患病率的上升带来了显著的临床和社会挑战。公众对此问题的关注度如此之高，以至于新批准的食物过敏药物登上了纽约时报的头版。对牛奶、花生和树坚果的致命反应已得到广泛认识，然而目前对过敏发病机制的理解仍存在空白，阻碍了预测和预防这些事件的能力。坚果，特别是树坚果，是全球人群过敏反应的主要原因之一，且在西方饮食中无处不在。目前尚无治愈榛子过敏的方法，患者必须坚持限制性饮食并随身携带自动注射肾上腺素。坚果过敏的负担不仅限于身体健康，还通过诱发压力和焦虑显著影响心理健康。坚果过敏患病率的上升进一步加剧了这些挑战，对生活质量产生负面影响。

榛子（Corylus spp.）是广泛消费食品的关键成分，特别是巧克力类产品，提供营养益处和独特风味。然而，榛子也是最强效的食物过敏原之一，是普通人群坚果致敏的主要原因。榛子过敏的患病率估计为欧洲成人0.86%，欧洲儿童0.28%，美国和澳大利亚人群0.60%。榛子过敏是欧洲食物过敏反应的第四大原因，产生多种症状，特别是在对高度稳定过敏原（如种子储存蛋白）敏感的患者中。与其他类型的食物过敏相比，对树坚果（包括榛子）的过敏往往持续终生，通常在2至5岁之间出现。过敏患者甚至可能对少量含榛子的食物产生反应，其引发阈值在食物过敏原中属于最低水平，这是由于某些榛子蛋白质的极端致敏性，这些是结构抗原。

榛子属于桦木科，是雌雄同株、自交不亲和、风媒传粉的阔叶物种，通常作为林下灌木与桦木和桤木一起生长。该物种的孢子体自交不亲和性受具有多个等位基因的单个基因座控制。随着工业需求的增长，榛子种植已在全球范围内扩大。树木通常通过枝条或根插条进行营养繁殖，以保持遗传一致性和缩短繁殖时间。欧洲榛子（Corylus avellana L.）和土耳其榛子（Corylus colurna L.）在欧洲广泛种植，是育种计划的重要遗传资源。

来自生态和地理多样性植物的种子可以携带特征性微生物群，这些通常通过遗传片段的扩增和测序来识别。附生微生物群可能包括协同、共生的潜在致病微生物，它们在健康和疾病易感性中扮演关键角色。这些通常存在于种子表面的微生物群在植物生长、发育和种子储存中发挥功能作用，种子携带的内共生菌有助于其他植物组织内的微生物种群。先前的研究已在欧洲榛子的花粉中鉴定出Spirosoma pollinicola sp. nov.。这种产生内毒素的细菌被认为有助于榛子花粉的高致敏性，导致上皮A549细胞释放趋化因子和细胞因子。花粉相关细菌可能在传粉过程中转移至种子。最近的研究表明，这允许植物微生物组通过花粉粒跨代传播，花粉粒作为细菌转移至发育中种子的载体。然而，微生物组转移对榛子致敏性的潜在影响目前尚不清楚。

基因组数据和蛋白质组数据为榛子育种提供了宝贵见解，特别是在努力降低过敏原蛋白含量方面。对来自四种榛子组织（包括叶片、葇荑花序、树皮和全幼苗）的互补DNA文库进行RNA-seq表征，导致组装了6.8 Gb的榛子转录组。对C. avellana cv. Tombul和C. colurna的从头转录组组装分别识别了70,265和88,343个unigenes。转录组数据、全基因组重测序、ChIP测序以及榛子基因组中差异表达基因的表征已被应用于研究胚珠和坚果发育的调控。然而，相对较少的研究探索榛子过敏原的遗传变异和控制。一项涉及12组过敏原蛋白和13个榛子品种的研究显示，所有样本具有相似的IgE反应谱。十个已识别的榛子过敏原是蛋白质（或糖蛋白）：Cor a 1、Cor a 2、Cor a 8、Cor a 9、Cor a 10、Cor a 11、Cor a 12、Cor a 13、Cor a 14和Cor a 15。其中，Cor a 9（11S种子储存球蛋白（豆球蛋白））、Cor a 14（2S白蛋白）以及程度较轻的Cor a 8（非特异性脂质转移蛋白（LPT））与最严重的过敏反应相关。然而，这些蛋白质在榛子中表达的遗传变异性仍然研究不足，关于它们在不同品种中丰度如何变化的信息很少，特别是对环境条件的响应。因此，本研究旨在调查榛子过敏原谱中自然环境和遗传变异的程度。本文报告的比较蛋白质组学分析揭示了主要商业榛子种植区之间过敏原蛋白组成的显著变化。这些变化与患者免疫反应相关，如皮肤点刺试验结果所证明，强调了品种选择在过敏原管理策略中的重要性。令人惊讶的是，我们在所有坚果样本中检测到Spirosoma蛋白质，表明这种内共生菌可能影响榛子的致敏性。

2 材料与方法

本研究使用的榛子样本来自世界不同地区，覆盖主要种植区：土耳其、意大利、智利、阿塞拜疆和美国。坚果经过分类、破壳、去壳和校准后运输，并进行与烘烤、加工和消费相同的严格质量检查。

2.1 脱脂面粉制备

生榛子经过五次研磨，每次2分钟，以获得细纹理。研磨后，使用研钵和杵将榛子粉均质成细粉以确保均匀性和最小粒径。为制备脱脂榛子粉，1克榛子粉用五体积正己烷提取，最后用五体积丙酮进行脱脂步骤。提取在4°C下进行，随后沉淀30分钟并过滤。脱脂后，榛子粉在通风橱中风干以去除任何残留溶剂。

2.2 蛋白质质量评估

脱脂面粉样本（100毫克）用1.5毫升十二烷基硫酸钠（SDS）缓冲液（pH=6.8）提取，如de Angelis等人所述，略有修改。每个样本在40°C加热20分钟，在热振荡器（Thermomixer Comfort, Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Hamburg）上以1000 rpm搅拌，然后离心。上清液用冷20% TCA/丙酮沉淀。沉淀随后用丙酮洗涤两次，并溶解在100微升尿素缓冲液（7 M尿素，0.1 M Tris pH=8，0.001 M EDTA和1% DTT）中，用于Bradford法蛋白质定量。随后15微克蛋白质在SDS PAGE丙烯酰胺梯度凝胶（Any kD Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels）上分离。剩余粉末随后用于鸟枪法蛋白质组分析。

蛋白质提取和所有质谱程序由Biogenity ApS（丹麦奥尔堡）执行如下。榛子粉末样本转移至含有100微升裂解缓冲液（由6 M盐酸胍，10 mM TCEP，40 mM CAA，50 mM HEPES，pH=8.5组成）和3毫米碳化钨珠（Qiagen）的1.5毫升LoBind Eppendorf管中。样本用TissueLyser II（Qiagen）处理两次，30微克样本用裂解缓冲液稀释至20微升，并进行消化和TMT标记（16plex标签，Thermo）。肽段在15 cm PepSep Endurance柱（Bruker）上通过44分钟梯度洗脱，并在配备FAIMS Pro接口（ThermoFisher Scientific）的Orbitrap Eclipse Tribrid仪器（Thermo Fisher Scientific）上分析，FAIMS Pro在-50和-70 V的CV之间切换，循环时间分别为2和1.5秒。全MS谱图以120,000分辨率收集，归一化AGC目标设置为“标准”或最大注入时间50 ms，扫描范围375–1500 m/z。强度>5×10³且电荷状态2–7的MS1前体被选择用于MS2分析。动态排除设置为120秒，排除列表在CV值之间共享，高级峰确定设置为“关闭”。前体拟合阈值设置为70%，MS2拟合窗口为0.7 m/z。选择用于MS2的前体在四极杆中以0.7 m/z窗口隔离。离子收集最大注入时间50 ms，归一化AGC目标设置为“标准”。 fragmentation使用CID归一化碰撞能量30%进行，MS2谱图在离子阱中以快速扫描速率获取。前体随后用TMT同量异位标签丢失排除和前体离子排除（低25 ppm，高25 ppm）过滤。前体使用四极杆以2 m/z窗口隔离用于MS3扫描，离子收集最大注入时间86 ms，归一化AGC目标300%。Turbo TMT停用，依赖扫描数设置为5。隔离的前体再次用50%归一化HCD碰撞能量碎片化，MS3谱图在Orbitrap中以50,000分辨率获取，扫描范围100–500 m/z。MS性能通过运行复杂细胞裂解物质量控制标准品验证一致性。原始文件使用Proteome Discoverer 2.4（Thermo Fisher Scientific）分析。在处理和共识步骤中启用TMT报告离子定量，谱图与从UniProt获取的C. avellana数据库匹配。动态修饰设置为氧化（M）、脱酰胺（N, Q）和蛋白质N末端的乙酰化。半胱氨酸羧酰胺甲基化（在C残基上）和TMT 16-plex（在肽段N末端和K残基上）设置为静态修饰。

2.3 数据分析

数据过滤仅包括至少有两个独特肽段、10%序列覆盖度和最小序列得分30的蛋白质。数据分析使用Perseus版本2.0.7软件进行。数据集过滤保留在所有样本中至少有60%有效值，或在每个实验组中至少有75%有效值，且归一化强度截止值100的蛋白质。过滤数据的log₂比值分布作为频率直方图分析。数据对称分布并用于下游分析。多样本ANOVA和两样本t检验使用Perseus默认设置进行（S0=0.1，错误发现率=0.05）。

蛋白质组学数据可通过PRIDE合作伙伴存储库在ProteomeXchange Consortium中获得，数据集标识符PXD052613和10.6019/PXD052613。

2.4 通过基因本体论进行榛子蛋白质功能分类

蛋白质功能谱和KEGG通路分析基于在所有榛子样本中识别的372种蛋白质集。使用UniProt数据库（Release 2014_02）的ID映射查找蛋白质GO术语。结果，蛋白质用相应的GO编号注释，然后使用ShinyGo 0.80和g:Profiler分类为生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）。

2.5 Spirosoma蛋白质

整个坚果在40°C水中洗涤5分钟，然后用乙醇洗涤。该过程重复三次，然后样本提取用于蛋白质组学分析。此外，其他样本在提取用于蛋白质组学分析前在漂白剂（10%）中浸泡5分钟。蛋白质组分析如去壳榛子所述进行， except that proteins were identified using the UniProt database。

2.6 皮肤点刺试验

皮肤点刺试验在31名4至14岁儿童（男女分布均匀，并进行口服食物挑战）中进行，这些儿童确诊榛子过敏。患者数量与食物过敏研究中致敏和反应推断所需的最小数量一致，即29人。本研究中使用的样本量因此适用于拟合食物过敏中的致敏分布。利用这些数据，还可以基于个体NOAEL和最低LOAEL，使用参数模型评估间隔删失失效时间数据的阈值反应性。从这个数量的患者获得的数据也用于低过敏性产品的评估。所有测试使用1至18品种的地面榛子样本与0.9%盐水混合进行。样本在患者身上重复测试。出现平均直径至少3毫米的风团被视为阳性反应。皮肤反应性通过测量风团面积来表达。

3 结果

3.1 Spirosoma检测

榛子样本从18个全球商业种植园收集。这些研究中进行的蛋白质组学分析揭示了所有种植商业区域的种子中存在Spirosoma。在榛子种子中识别的细菌蛋白质包括许多代谢酶，表明细菌在种子内保持活力。此外，广泛的清洗或种子表面灭菌未能去除这些蛋白质，表明与种子微生物组存在稳定关联。序列比较证实，图中的蛋白质来自S. pollinicola sp. Nov，先前已通过HA7^T与Spirosoma linguale DSM 74^T和Spirosoma fluviale DSM 29961^T的基因组比较识别。

3.2 榛子蛋白质组

鸟枪法蛋白质组学能够全面分析商业品种的榛子蛋白质组。肽段序列与已建立数据库（包括UniProt、Allergome、NCBI和Ensembl Plants）的比对。这些数据库用于识别所有已知榛子过敏原及其变体。主成分分析显示，榛子蛋白质组可变，并根据原产地进行分组。Tonda di Giffoni树在多个地区种植（意大利、智利和格鲁吉亚；位置4、6和14），而Tonda Gentile Trilobata在意大利和智利种植（位置5和8）。Barcelona品种在智利和美国种植（位置7和16）。一些来自不同来源的样本比其他样本更紧密地聚类，这可能反映了区域对蛋白质组组成的影响。

在榛子蛋白质组中识别的1953种蛋白质中，1216种蛋白质在所有样本中常见，637种蛋白质仅在特定品种组合中检测到。此外，在一个或多个样本中识别了140种独特蛋白质。然而，许多这些蛋白质的归一化强度值低于100的截止阈值。因此它们被排除在进一步分析之外。在在所有样本中找到的1216种蛋白质中，621种进行了进一步分析。发现372种蛋白质存在显著差异丰度。

坚果蛋白质组基因本体术语的功能富集识别了424种属于MF类别的蛋白质，809种属于BP类别，169种属于CC类别。榛子蛋白质组的基因本体（GO）功能富集分析显示，371种蛋白质在丰度上存在统计学差异。许多这些差异丰度的蛋白质已知参与代谢，如碳水化合物储存和周转（例如，淀粉酶、淀粉合酶）和应激耐受及防御（例如，超氧化物歧化酶），以及其他重要细胞功能。在MF类别中的212种蛋白质中，大多数被指定具有催化功能（GO:0140096）、水解酶活性（GO:0008152）、ATP结合（GO:0005524）和过氧化物酶活性（GO:0004601），以及碳水化合物结合（GO:0030246）。被归入BP类别的84种蛋白质的功能包括磷代谢（GO:0006793）、对刺激的反应（GO:0050896）和运输（GO:0006810）。只有25种蛋白质被分类在GO术语CCs内，该术语根据蛋白质在细胞间（细胞壁/质外体）和细胞内区室的定位分配蛋白质。这些包括位于质外体（GO:0048046）和细胞质（GO:0005737）的蛋白质，以及定位在膜复合物（GO:0098796）和核糖体（GO:00057840）的蛋白质。通路富集分析将372种差异丰度蛋白质分配至通路。榛子蛋白质组中许多差异表达的蛋白质参与碳水化合物代谢，以及营养储备和能量代谢，特别是涉及苹果酸、丝氨酸和葡萄糖6-磷酸通路。这些蛋白质的KEGG ID可在支持信息S5:表2中找到。此外，支持信息S6:表3显示了三个GO类别（BP、MF和CC）的前10个富集GO ID。

3.3 过敏原识别

榛子过敏原基于世界卫生组织（WHO）和国际免疫学协会联合会（IUIS）过敏原命名数据库，以及C. avellana过敏原和iso-过敏原的Allergome列表进行识别。检测到的过敏原包括Cor a 1（Bet v 1同源物）、Cor a 2（profilin）、Cor a 8（LPT）、Cor a 9（11S legumin）、Cor a 11（7S vicilin）、Cor a 14（2S albumin）以及oleosins Cor a 12、Cor a 13（oleosin蛋白类型）和Cor a 15（7S vicilin型种子储存蛋白）、Cor a 16（2S albumin）和Cor a thaumatin-like protein（TLP）。应用严格的选择标准以确保可靠和显著的过敏原识别。这包括最小序列覆盖度10%、至少两个独特肽段和序列得分高于30。一个覆盖度较低（12%）的例外是Cor a 16。然而，与其相关的高数量独特肽段为正确识别该过敏原提供了信心。第二个例外是次要过敏原Cor a TLP，它被少于10%的榛子过敏患者识别。在本分析中，该蛋白质以低置信度识别，仅基于1个独特肽段，且所有识别肽段的覆盖度为6%。因此未进行进一步分析。

3.4 Iso-过敏原和过敏原变体

大多数过敏原，包括Cor a 6、Cor a 8、Cor a 10、Cor a 13、Cor a 14和Cor a 15，仅由一个同种型代表，如单个变体所识别。相比之下，Cor a 1由多个同种型代表（Cor a 1.0101至Cor a 1.0801：Allergome数据库）。在18个样本中识别了三个同种型：Cor a 1.0401、Cor a 1.0402和Cor a 1.0501。一些过敏原，包括Cor a 2、Cor a 9和Cor a 11，由两个或更多同种型代表：Cor a 2、Cor a 2.0101；Cor a 9、Cor a 9.0101；以及Cor a 11.0101、Cor a 11.0102。每对同种型表现出高度同源性（98%），序列仅相差几个氨基酸。Cor a 2和Cor a 11由单个基因编码，而Cor a 9的两个同种型由两个不同基因编码。在Allergome数据库中列出的三个Cor 16同种型中，只有一个同种型在测试的榛子样本中检测到， subjected to the present analysis。

3.5 品种依赖性过敏原组成变化

Cor a 9和Cor a 11蛋白质在所有样本中比其他过敏原更丰富，而Cor a 1.05、Cor a 2、Cor a 11.0102和Cor a 13.0101丰度最低。观察到Cor a 1、Cor a 2、Cor a 9、Cor a 11和Cor a 12同种型的相对丰度存在显著差异，其中Cor a 11最丰富。Cor a 11.0101水平比Cor a 11.0102高60%。Cor a 8、9、11和14仅占总坚果蛋白质的约1%–4%。

坚果过敏原的层次聚类揭示了某些样本间蛋白质丰度的显著差异。成对比较识别了两个或多个品种间主要过敏原水平的显著差异。为简单起见，样本间相对丰度的变化仅显示四种主要过敏原。例如，Cor a 9.0101水平在样本4、14和17中显著较低，而Cor a11水平在样本5和8中显著较低。相反，Cor a 8同种型在样本12和18中最丰富。

3.6 对榛子品种免疫反应的变化

对榛子过敏患者的皮肤点刺试验分析显示，对来自6个种植区（阿塞拜疆、智利、格鲁吉亚、意大利、土耳其和美国）的18个样本的坚果提取物的平均风团大小和因此的反应存在变化。在品种8、18和14中观察到较弱的免疫反应，这些品种的Cor a 9.0101和Cor a 11水平低于其他样本，与其他品种相比。相反，品种2、10和11显示出强得多的反应。使用Pearson相关统计方法进一步分析了18个种植区之间皮肤点刺试验和过敏原水平之间的关系。对于大多数过敏原，相关性较弱或可忽略（R_s范围-0.22至0.34，p值范围0.04至0.86 L）。然而，对于Cor a 9（R_s=0.59；p值=0.0097）和Cor a 9.0101（R_s=0.48；p值=0.042）观察到正统计显著相关性。

4 讨论

全球榛子供应链需要全年供应高质量新鲜榛子。除了现有种植区，新的种植园正在智利、俄勒冈、格鲁吉亚和巴尔干国家等地区出现。来自所有商业来源的坚果均含有Spirosoma作为内共生菌，表明细菌与坚果之间关系的普遍性。我们的发现提供了第一个证据，表明所有商业来源的榛子都含有Spirosoma作为内共生菌，可能通过花粉转移。虽然此类微生物群通常存在于种子表面，并经常通过遗传片段的扩增和测序识别，但此处提供的数据揭示了坚果内Spirosoma蛋白质的存在，因为它们无法通过反复清洗或灭菌去除。尽管Spirosoma蛋白质存在的功能意义尚不清楚，但它们的 presence 可能影响榛树种子的整体蛋白质组成。这一发现为进一步研究微生物与宿主之间的相互作用奠定了基础，这些相互作用影响坚果过敏原含量。需要进一步的微生物学和免疫学研究以确定Spirosoma在榛子致敏性中的作用。本研究中揭示的蛋白质组成的观察到的基因型变异为影响坚果蛋白质组的基因型/环境相互作用提供了 novel insights。我们已经识别出来自不同商业来源的榛子蛋白质组成的小而重要的变化。虽然加工可以显著降低个体坚果过敏原的水平，但坚果的蛋白质组成固有地依赖于遗传成分及其调控。

蛋白质组学方法先前已用于分析加工在降低榛子蛋白质致敏性方面的影响，并评估13个遗传多样性榛子集的致敏潜力。有趣的是，尽管榛子品种遗传多样性且可能存在品种依赖的IgE结合特性差异，但在测试的13个榛子品种中，编码Cor a 8、Cor a 9和Cor a 14的基因水平仅发现微小差异。本研究中进行的鸟枪法蛋白质组学很大程度上支持这一结论，然而揭示了品种间主要过敏原水平的小但显著差异。此外，主成分分析揭示了与地理起源和遗传背景相关的显著蛋白质组变化。值得注意的是，某些过敏原水平，如Cor a 9.0101，在某些样本（4、14和17）中显著较低，而Cor a 8同种型在样本12和18中最丰富。需要进一步研究以确定此类差异对榛子整体致敏性的全部意义。

由于时间关系，本研究未关注所有坚果样本中存在的1216种蛋白质，或仅在一个或多个样本中识别的独特蛋白质。然而，对这些数据的未来分析可能有助于揭示支撑观察到的过敏原水平差异的分子和代谢机制。重要的是，我们的研究发现过敏原积累的变化与患者免疫反应的变化相关。此处报告的皮肤点刺试验揭示了免疫反应强度的变化，与Cor a 9同种过敏原的丰度相关。鉴于该参数测量的半定量性质，需要涉及更大患者队列的进一步研究以充分探索不同样本中过敏原水平与免疫反应强度之间的关系。

此处提供的数据将来源17和18识别为具有较低水平关键抗原，使它们成为旨在降低特定抗原水平的遗传干预的主要候选者。这是植物过敏原科学的关键下一步，因为榛子和其他树种子中的许多主要过敏原是热稳定的，因此在加工过程中高度抗降解。榛子体外培养物用于商业生产次级代谢物，如紫杉醇。此外，榛子小植株可以通过外源生长调节剂诱导分化的愈伤组织再生。因此，应该可能异位表达调节全能性和刺激细胞增殖的转录因子，同时沉默其他转录因子以刺激小植株形成和加速开花。然后可以使用CRISPR-CAS技术降低榛子种子中特定过敏原蛋白质的表达。

最后，我们的发现证实，来自生态和地理多样性商业树木的榛子种子可以携带S. pollinicola。尽管这种内共生菌对树木生长和发育的功能意义未知，但这种转移促进了S. pollinicola在下一代花粉中的存在。因此，从花粉中有效去除细菌需要从种子中严格消除内共生菌。更深入地了解种子微生物组对于制定减轻植物器官致敏性的策略至关重要。