乳酸菌中底物抑制的机制性双途径建模，以增强发酵控制

《Quantitative Biology》：Mechanistic two-pathway modeling of substrate inhibition in lactic acid bacteria for enhanced fermentation control

乳酸菌发酵中底物抑制的机理建模与验证，提出双路径模型整合分子调节与生长动力学，揭示延滞期延长及生长抑制规律，通过Lactobacillus bulgaricus、casei、plantarum等菌株实验验证模型普适性，优化接种物生理状态可缓解高浓度底物抑制，为生物工艺设计提供新方法

　　本研究探讨了乳酸菌（LAB）发酵过程中出现的底物抑制现象，并提出了一种结合分子调控路径与典型底物同化及微生物生长路径的机制性双路径模型。该模型能够捕捉到在不同初始底物浓度下的全局生长动态，包括滞后期、指数期和稳定期，并且仅需一组参数即可实现对整个过程的描述。通过与多种乳酸菌（如嗜热链球菌、干酪乳杆菌和乳酸乳球菌）在乳糖底物下的实验数据进行对比验证，模型展现出良好的普适性，能够超越特定的底物-菌株系统。此外，模型模拟还揭示了通过适当的预培养处理来调节菌种初始生理状态，可能是应对高底物浓度下底物抑制的一种有效策略。模型预测还展示了不同初始菌体量对微生物生长动态和最佳发酵条件的影响，为工业发酵中底物利用效率的优化提供了新的思路。

在发酵工业中，乳酸（LA）生产正逐步向使用农业工业废弃物作为碳源的优化过程发展。这些废弃物不仅成本低廉，而且具有高效的底物转化能力。然而，底物抑制现象仍然是一个显著的挑战，它会减缓微生物生长，从而影响LA的产量。许多研究尝试通过建立底物浓度与微生物生长速率之间的关系来解释这一现象。例如，Haldane–Andrews方程和Aiba–Edwards方程被广泛用于描述底物抑制效应。尽管这些模型在许多发酵过程中通过统计曲线拟合能较好地再现实验数据，但它们仍然未能揭示底物抑制的分子机制。同时，由于不同抑制函数的广泛差异，这些经验性模型在仅依赖统计技术时，往往难以进行准确评估。因此，多数研究仅针对特定的生物过程，旨在为工业发酵提供最优参数。这种局限性使得模型在不同生物和微生物种类之间缺乏统一性。

微生物的生长曲线通常包括滞后期、指数期、稳定期，有时还包括死亡期。然而，滞后期的重要性往往被低估，无论是实验还是理论研究中都较少关注。事实上，尽管在滞后期内没有明显的生长，但越来越多的证据表明，微生物在该阶段仍然具有代谢活性，对环境压力作出反应。例如，有研究表明，在木质纤维素水解过程中积累的糖分可能会抑制酶活性，导致滞后期延长，从而降低LA的平均产量。然而，目前仍不清楚在不同底物浓度下滞后期的生理过程是怎样的，以及营养供给如何影响微生物的生长动态和菌群结构。因此，结合定量实验与数学建模的综合性框架对于理解微生物在恶劣环境中的生长机制以及优化工业反应器中的底物利用至关重要。

微生物发酵是一个复杂的生理过程，其结果在很大程度上由底物的供给和利用决定。实验观察表明，某些关键酶如乳糖渗透酶和β-半乳糖苷酶在碳底物的水解过程中发挥重要作用。例如，有研究指出，如果在仅以乳糖为底物的环境中缺乏β-半乳糖苷酶，细胞将无法正常生长。同时，这些酶的合成也会受到底物浓度的影响。此前的实验表明，底物的持续积累可能会抑制β-半乳糖苷酶的活性，从而导致底物利用效率下降和微生物生长受限。因此，合理调控这些酶的活性对于优化细胞生长和产物合成具有重要意义。

本研究旨在通过批式发酵条件下的实验数据，探讨乳酸菌发酵中底物抑制的动态特性，重点关注微生物在不同底物浓度下的生理适应性反应。基于多种微生物发酵过程的实验数据，我们对预测模型中的底物抑制现象进行了评估。模型结合了典型的微生物生长路径与一个响应底物浓度的调控路径。在典型的生长路径中，底物被转化为细菌的生长，进而产生乳酸。而调控路径中引入了一个关键的细胞内蛋白Q，用于调节底物利用和细胞生长。这种粗粒化模型在保持关键酶特征的同时，使得模型在数学上易于处理。

根据Baranyi–Roberts模型，细胞的生理状态随时间变化遵循一级动力学规律。生理状态的变化速度与微生物对新环境的适应能力相关，通常被建模为一个指数过程。研究还假设，关键蛋白的合成受到底物浓度的调控，其过程可能遵循Hill函数。因此，生理状态的变化可以表示为一个与底物浓度相关的方程，该方程中的参数反映了底物抑制的强度。

在发酵过程中，乳酸的生产通常遵循Luedeking–Piret方程，该方程描述了乳酸浓度与菌体浓度之间的关系。根据该方程，乳酸的生成可以分为与生长相关的部分和与生长无关的部分。这一模型在结合微生物生长路径和调控路径后，能够更全面地描述底物抑制的动态特性。

为了验证模型的有效性，我们对嗜热链球菌在乳糖底物下的发酵过程进行了数值模拟。实验数据表明，当初始底物浓度为26 g/dm3和43 g/dm3时，模型预测的生长曲线与实验数据高度吻合。模型参数通过最小二乘拟合方法从实验数据中提取，结果表明模型能够准确描述微生物在不同底物浓度下的生长动态。特别是在高底物浓度下，模型预测的滞后期显著延长，这与实验观察一致。

此外，我们还研究了不同初始生理状态对微生物生长动态的影响。实验数据显示，当初始生理状态较低时，微生物的生长速率呈现出非单调的变化趋势，即在某些底物浓度下达到峰值，而在其他浓度下则受到抑制。这种现象表明，微生物的生理状态对底物抑制具有重要影响。因此，通过适当的预培养处理，提高菌种的初始生理状态，可以有效缓解底物抑制，缩短滞后期，从而提高发酵效率。

在高底物浓度环境下，微生物通常需要更长的适应时间，这导致了滞后期的延长。这一现象在多种生物过程中都有观察到，如酚类物质的生物降解、乙醇发酵、乳酸生产以及琥珀酸生产等。因此，了解并优化微生物的生理适应性，对于提高发酵效率和产物产量具有重要意义。

为了进一步理解底物利用的机制，我们还研究了微生物在不同底物浓度下的能量维持情况。通过分析生长产率与生长速率之间的关系，我们发现，在底物浓度较低时，能量维持系数相对稳定，而在浓度较高时，该系数显著增加。这表明，微生物在高底物浓度下需要更多的能量来维持其生长和代谢活动，从而导致底物抑制现象的加剧。这一发现对于优化发酵条件和提高生产效率具有指导意义。

在实际应用中，微生物的初始菌体量对发酵过程的影响不容忽视。例如，在干酪乳杆菌的发酵过程中，不同初始菌体量的实验数据表明，较高的初始菌体量能够缩短滞后期，从而提高发酵效率。这提示我们，在工业发酵过程中，选择合适的初始菌体量和底物浓度是优化生产的关键因素之一。

综上所述，本研究提出的双路径模型不仅能够有效描述乳酸菌发酵过程中的底物抑制现象，还揭示了微生物生理状态和底物浓度之间的复杂关系。该模型的普适性在多种乳酸菌的实验数据中得到了验证，表明其适用于不同的底物-菌株系统。通过模型的预测，我们可以更好地理解微生物在不同环境条件下的适应策略，并为工业发酵过程的优化提供理论支持和实践指导。未来的研究应进一步探索关键酶的调控机制，以及不同微生物-底物组合下的模型通用性和预测准确性，以推动发酵技术的进一步发展。