DNA宏条形码技术揭示了阿尔卑斯山脉北部和侏罗山脉地区的狼的饮食模式

《Wildlife Biology》：DNA metabarcoding reveals wolf dietary patterns in the northern Alps and Jura Mountains

灰狼在瑞士阿尔卑斯和汝拉山脉的饮食分析显示，其食物以红鹿、狍子和岩羊为主，占比达80.8%。研究采用DNA条形码技术分析698份粪便样本，发现狼的饮食受地区、季节和社会结构（群狼vs独狼）显著影响：群狼更依赖大型猎物，独狼偏好狍子；冬季红鹿消费量增加，夏季岩羊更常见。研究证实非入侵性DNA技术能有效评估狼的食性，为野生动物管理提供依据。

　　狼的捕食行为研究对于野生动物管理和人与野生动物共存至关重要，特别是在多用途景观中。随着狼群重新占据其历史栖息地，了解它们的饮食结构对于保护、管理以及公众接受度具有重要意义。然而，阿尔卑斯地区和汝拉山脉的狼的饮食数据仍然较为稀缺。狼作为机会性捕食者，会根据当地猎物的分布情况调整其捕食行为，这表明野生偶蹄动物可能是其主要食物来源。我们还预期狼的饮食结构会受到地区、季节和群体结构的影响。DNA宏条形码技术作为一种新兴的生态研究工具，能够提供高分辨率的饮食信息，尽管在狼的研究中应用仍然有限。本研究通过分析2017年至2024年间在瑞士收集的698个狼粪便样本，发现红鹿是大多数地区的主导猎物，与 Roe 鹿和岩羚羊一起占了80.8%的序列。研究结果还显示，阿尔卑斯和汝拉山脉之间的猎物选择存在相似性，但季节和群体结构之间的差异显著。这项研究为瑞士北部阿尔卑斯和汝拉山脉的狼的饮食结构提供了首次详细的分析，为野生动物管理提供了关键的见解。

在人类主导的景观中，狼与人类社会的互动可能引发负面的人与野生动物冲突，这主要源于其对牲畜的捕食行为。这种行为常常导致公众对狼保护的负面看法和争议。此外，狼对狩猎物种的影响及其与现有狩猎和野生动物管理策略的整合仍不清楚。饮食的差异还可能与狼的群体结构有关，例如群体狼与非群体狼之间的差异在全球范围内仍处于研究的初步阶段。这种差异对管理具有重要的意义，因此需要进一步的研究。关于狼的行为，尤其是饮食方面的误解也加剧了这些冲突，凸显了科学数据在指导管理及公众理解中的必要性。

在欧洲，狼正在重新占据那些具有高牲畜密度、多用途景观和丰富偶蹄动物种群的地区，这为深入研究狼的饮食提供了紧迫的需求。已有研究在狼存在时间较长的地区，如北欧、东欧和南欧，但目前重新占据的地区，如中欧和西欧，关于狼饮食的数据仍然有限。阿尔卑斯北部和汝拉山脉作为狼重新占据的区域，提供了独特的研究机会，因为这些地区具有欧洲最高的偶蹄动物多样性。此外，传统的夏季牧场管理也使这些地区成为狼与牲畜相互作用的热点。尽管这些地区在生态上具有重要地位，但我们对狼如何利用丰富的偶蹄动物和牲畜资源仍然缺乏详细的信息。

本研究的目标是通过DNA宏条形码分析瑞士狼粪便样本，探讨狼的饮食结构及其生态角色。我们旨在评估地区、季节和群体结构对狼饮食的影响，并评估猎物的偏好与其可利用性之间的关系。此外，我们还考虑了样本收集的背景，以验证其在饮食研究中的适用性并支持未来的研究。

我们假设，由于偶蹄动物的高数量和全年可获得性，瑞士狼的主要猎物是野生偶蹄动物，而牲畜则构成了次要成分，与公众的普遍看法相反。红鹿预计在狼的饮食中占据主导地位，反映其在狼群建立或重新建立的地区中普遍的高数量。此外，狼群可能倾向于捕猎较大的猎物，而非群体狼可能更多依赖较小的猎物，如Roe鹿和绵羊。季节性变化也被预期，尤其是在夏季，牲畜在牧场上的暴露程度增加，而野生偶蹄动物则依赖季节性迁徙和其易受攻击性。这些因素共同影响狼的饮食结构。

研究区域涵盖了瑞士的阿尔卑斯和汝拉山脉，这些区域因地形多样而提供了不同的栖息地。狼群数量近年来显著增加，至2024年的监测年份达到了39个狼群。这些狼主要来源于意大利狼群，自1990年代开始在瑞士境内重新分布。瑞士的狼群是自然恢复的结果，而非人为引入。狼在瑞士的分布跨越了多个生态区域，包括崎岖的阿尔卑斯山和较为平坦的中央高原。这些区域的猎物组成和分布情况各不相同，为研究狼的饮食提供了丰富的背景信息。

为了确保研究的全面性，我们考虑了样本收集的背景，即样本是在牲畜猎杀现场、野生动物尸体旁还是独立于尸体收集。通过比较这三种背景下牲畜和野生动物的比例，我们利用卡方检验来评估其差异。此外，我们还测试了包含在野生动物尸体旁收集的样本是否显著改变了整体结果。结果显示，样本收集背景对狼的饮食结构产生了重要影响，尤其是在靠近牲畜尸体的样本中，牲畜的比例显著高于其他两种情况。

DNA提取过程在瑞士洛桑大学的专门低DNA含量实验室中进行，所有样本都保存在酒精中，直到提取完成。使用QIAamp Fast DNA Stool试剂盒进行DNA提取，遵循制造商的建议。提取后的样本在PCR扩增前被稀释五倍。这种稀释有助于提高样本中非狼DNA的检测比例，减少狼DNA在最终测序结果中的冗余。

为了限制狼DNA的扩增，我们在PCR反应混合物中加入了针对狼的阻断引物。该引物的前6个碱基与Vert01正向引物的后6个碱基重叠，从而抑制狼DNA的扩增。由于狼粪便中狼DNA含量最高，加入阻断引物有助于提高非狼DNA的比例。我们通过定量PCR测试了阻断引物的性能，并根据测试结果调整了阻断引物的浓度，以确保扩增的准确性和效率。

DNA宏条形码和测序过程采用了标记引物和随机间隔序列，以提高测序的复杂度和聚类检测的准确性。PCR反应混合物包括AmpliTaq Gold 360 Master Mix、标记的正向和反向引物、BSA和阻断引物。每个PCR反应的最终体积为20微升，包含2微升的DNA模板。PCR热循环程序包括95°C的初始变性、40轮扩增（每轮包括95°C的变性、49°C的退火和72°C的延伸），最后在72°C进行7分钟的延伸。每个样本在三个重复中进行扩增，以确保数据的可靠性和一致性。

在PCR扩增和混合后，使用MiniElute PCR纯化试剂盒进行纯化。纯化后的样本通过Qubit 2.0荧光计进行量化，并使用Fragment Analyzer分析片段长度分布。为了进一步提高数据的准确性和完整性，我们使用了TrueSeq PCR-free Library Prep试剂盒，并遵循Tagsteady协议。在测序前，通过Fragment Analyzer验证了接头是否正确连接。最终的测序在Illumina MiniSeq平台上进行，以2×150 bp的配对末端测序方式。由于测序的顺序进行，我们分三次完成了样本的测序，每次使用不同的样本集。

在生物信息学处理过程中，我们使用了OBITools软件包进行原始序列数据的处理和初步筛选。通过将正向和反向序列配对（质量分数至少为40），我们能够更准确地识别样本来源。每个序列的标签和引物被保留为序列标题的一部分，而去除标签和引物以减少数据量和计算时间。我们还去除了在每个库中读数少于10个的序列，以及不符合预期Vert01条形码长度范围的序列。随后，我们使用obiclean函数计算序列之间的成对差异，并将低丰度序列聚类到最丰富的序列中。Sumaclust算法用于进一步细化聚类结果，基于97%的序列相似性。该算法依赖于与UCLUST相同的聚类方法，用于识别扩增和测序过程中产生的错误序列，这些序列源自其主要序列（质心序列）。

保留的序列通过EMBL数据库进行分类学分配，以确定它们对应的物种。分类学分配使用obitools软件包中的ecotag函数进行，该函数在数据库序列中找到最佳匹配，并打印出该序列及其相似性百分比。为了确保自动分类的准确性，我们使用BLASTn工具对这些操作分类单元（OTUs）进行了双重检查，以确认其分类的正确性。数据清洗过程在R（版本4.0.2）中进行，我们使用了metabaR软件包，该包推荐了默认设置，以优化测序输出。

在处理过程中，我们根据每个板的样本类型（如样本、提取、负控、空白或正控）标记序列，以识别潜在的污染。例如，那些在提取和负控中比样本中更丰富的序列被视为污染序列并被移除。该软件包还比较了各重复之间的差异，并根据每个样本的重复差异进行参考，以去除差异过大的序列。我们还去除了总读数少于100的重复，因为这些重复被认为是低覆盖度。这一过程在每个库中独立进行，以生成干净的数据集，这些数据集直接用于统计分析。

经过生物信息学处理后，我们获得了所有样本的脊椎动物序列，共计698个样本。其中，665个样本至少包含一个非狼序列，而33个样本仅包含狼序列，尽管加入了阻断引物。这表明，虽然阻断引物有效降低了狼序列的比例，但在某些情况下，仍无法完全排除狼DNA的污染。

在分析检测到的猎物出现频率和相对读数丰度（RRA）时，我们考虑了季节、地理区域和群体结构等预测变量。我们通过将样本的空间位置与特定年份的狼群领地多边形进行比较，将样本归类为群体狼或非群体狼。非群体狼包括离散个体、独居狼或配对狼，配对狼如果在同一年繁殖则被视为群体。我们对五个最频繁出现的OTU进行了统计分析，这些OTU后来被定义为猎物或被消费的物种。然而，我们的分析主要基于RRA，因为RRA在定量上更准确，相比PA或FOO能够更好地反映实际消费比例。

在对检测到的猎物物种进行分析时，我们注意到RRA的分布呈现出明显的双峰模式，其中33%的值低于0.1，而53%的值高于0.9。这表明狼的粪便样本中，大多数情况下仅包含一种猎物DNA，而其他物种的DNA则作为补充存在。单次检测的小型物种被归类为“其他物种”，但在支持信息中列出。这些结果揭示了狼在不同区域和季节的捕食行为，以及其对不同猎物的选择性。

我们还计算了狼消费的生物量，基于每只成年狼每天需要2.6公斤纯肉的代谢需求，得出每只狼每年约消耗950公斤纯肉的结论。此外，我们将消费量转换为活体猎物的体重，通过增加25%的估计，得出每只狼每年约消耗1186公斤猎物体重。RRA的使用使这一转换成为可能，因为它提供了更定量的分析方法，适用于相对消费量的计算。

为了评估狼对不同猎物的选择性，我们利用了相机陷阱数据，以确定猎物的相对丰度。我们选择了位于主要狼群活动区域的相机陷阱事件，并与狼粪便样本的收集时间相匹配。相机陷阱数据帮助我们比较了不同区域猎物的出现频率，并据此计算了Jacob选择性指数。在某些区域，如汝拉山脉，由于相机陷阱数据的缺失，我们无法进行选择性分析。在其他区域，如南方阿尔卑斯和东部瑞士阿尔卑斯，红鹿、Roe鹿和岩羚羊的出现频率较高，显示出狼对这些猎物的偏好。

通过比较不同区域、季节和群体结构对狼饮食的影响，我们发现红鹿在所有区域和群体结构中都是最常被检测到的猎物，而Roe鹿和岩羚羊的消费比例在不同季节和区域之间存在显著差异。非群体狼在冬季对Roe鹿的消费比例更高，而在夏季和秋季则更多依赖岩羚羊。这些发现表明，狼的捕食行为受到季节性猎物可获得性和群体结构的影响。群体狼倾向于捕猎较大的猎物，而非群体狼则可能更多依赖较小的猎物。

在分析过程中，我们还发现样本收集背景对狼的饮食结构有重要影响。靠近牲畜尸体的样本显示出较高的牲畜比例，而偶然收集的样本则显示较低的比例。这种差异表明，狼在不同环境中对猎物的选择存在显著变化。为了确保分析的准确性，我们强调了在饮食研究中记录样本收集背景的重要性，尤其是在非系统性采样条件下。

尽管DNA宏条形码技术在狼饮食研究中具有重要价值，但其应用仍面临一些挑战。例如，DNA保存条件的差异、消化过程的影响以及捕食行为的多样性，都会对结果产生不确定性。因此，我们需要更多的研究来优化RRA的解释，并开发更精确的生物量估算模型。此外，由于RRA并不能提供猎物年龄或体重的信息，因此在将RRA转换为实际消费量时需要谨慎处理。

本研究的结果为狼在阿尔卑斯和汝拉山脉的饮食结构提供了新的见解，同时也揭示了其在不同区域和季节的捕食行为变化。红鹿作为主要猎物，其消费比例在所有区域和群体结构中都较高，这支持了我们关于红鹿在狼饮食中占据主导地位的假设。然而，对于其他猎物，如Roe鹿和岩羚羊，其消费比例受到季节性和猎物可获得性的显著影响。

此外，研究还揭示了狼在不同群体结构中的捕食行为差异。非群体狼在冬季更倾向于捕猎Roe鹿，而群体狼则更多依赖较大的猎物，如红鹿和岩羚羊。这种差异可能与群体狼的捕猎策略和资源利用有关。群体狼可能具有更强的捕猎能力，能够捕猎较大的猎物，而非群体狼则可能更多依赖小型猎物。这种现象在其他研究中也有所体现，表明群体结构对狼的捕食行为具有重要影响。

季节性变化对狼的饮食结构同样具有显著影响。红鹿的消费比例在全年中相对稳定，而Roe鹿和岩羚羊的消费比例则随季节变化。在冬季，Roe鹿的消费比例较高，而在夏季和秋季，岩羚羊的消费比例增加。这种季节性变化可能与猎物的活动模式和可获得性有关。例如，冬季Roe鹿可能在某些地区更为集中，而夏季岩羚羊的幼崽可能更容易被捕猎。

在非群体狼中，我们还发现其对牲畜的消费比例相对较低，尤其是在夏季，当牲畜在牧场上的暴露度增加时，非群体狼可能更倾向于捕猎野生偶蹄动物。这种现象可能与非群体狼的捕猎经验有关，因为它们可能缺乏捕猎大型牲畜的能力。相反，群体狼可能在捕猎牲畜方面更具优势，尤其是在夏季，当猎物的分布和可获得性较高时。

尽管本研究提供了有价值的见解，但其结果仍存在一定的局限性。首先，关于牲畜的可获得性和保护措施的数据较为有限，这使得我们难以准确评估狼对牲畜的选择性。其次，样本数量在某些区域，如汝拉山脉，相对较少，这可能影响结果的统计显著性。此外，将RRA转换为实际消费量仍存在挑战，因为这需要了解猎物的年龄和体重分布，而这些信息在DNA宏条形码方法中并未提供。因此，我们需要更多的研究来提高这种方法的准确性和实用性。

本研究的结论表明，狼在阿尔卑斯和汝拉山脉的饮食结构主要依赖于野生偶蹄动物，尤其是红鹿。这一发现支持了狼在这些地区的生态角色，即作为顶级捕食者，对猎物种群产生重要的生态影响。此外，研究还揭示了狼在不同季节和群体结构中的捕食行为差异，这对于制定有效的野生动物管理策略具有重要意义。通过结合样本收集背景，我们能够更全面地理解狼的饮食结构，从而为未来的生态研究提供更准确的参考。

总体而言，DNA宏条形码技术为狼的饮食研究提供了一种高效、精确和全面的方法。这种方法不仅能够检测到传统方法难以识别的小型和稀有猎物，还能够提供定量的消费比例。然而，为了进一步提高其应用价值，我们需要更多研究来优化RRA的解释，并开发更精确的生物量估算模型。此外，整合样本收集背景到饮食分析中，对于提高非系统性采样条件下研究的准确性具有重要意义。未来的研究应关注狼群体结构对捕食行为的影响，并探索更详细的分子方法，以更全面地理解狼的生态角色和其对猎物种群的影响。这些研究将有助于优化野生动物管理和保护策略，促进人与狼的共存。