高通量合成与筛选一种氰亚胺化合物库，成功发现了能够选择性抑制ISG15特异性蛋白酶mUSP18的抑制剂

《ANGEWANDTE CHEMIE-INTERNATIONAL EDITION》：High-Throughput Synthesis and Screening of a Cyanimide Library Identifies Selective Inhibitors of ISG15-Specific Protease mUSP18

高效合成与筛选去泛素化酶（DUB）靶向化合物库，利用Echo声波液体处理器在1536孔板内直接合成并筛选，发现新型USP18抑制剂BB07CA902（35nM），具有高选择性和细胞增强ISGylation效果。

　　在现代药物研发过程中，高通量筛选（High-Throughput Screening, HTS）作为一项关键技术，通常被用作识别具有潜在治疗价值的化合物的初步步骤。这一过程依赖于高质量的化合物库，而传统方法在构建这类库时往往面临高成本、高人力投入以及耗时较长的问题。为了解决这些问题，研究人员开发了一种新型的合成与筛选一体化技术，能够在实验板内高效地生成并立即进行高通量筛选，从而显著提升药物发现的效率和精准度。该技术的核心在于利用Echo声波液体处理系统，这种系统通过声波将纳米至微升级别的反应液精准地转移至目标板中，实现了在1536孔板中的微型合成。这种策略不仅减少了反应所需的试剂体积，还降低了成本，同时确保了合成产物可以直接用于筛选，避免了额外的纯化步骤，从而加快了整个流程。

在本研究中，重点聚焦于针对去泛素化酶（Deubiquitinases, DUBs）的化合物库构建与筛选。DUBs是一类能够去除泛素（Ubiquitin）修饰的酶，它们在细胞内广泛参与调控蛋白质的稳定性、定位和功能，是多种疾病的潜在治疗靶点。然而，DUBs的结构复杂性使得传统筛选方法难以获得具有高选择性和强效性的抑制剂。因此，开发一种能够快速生成大量DUB靶向化合物的方法成为当前药物研发领域的重要课题。研究人员选择了一种被称为“氰酰胺”（cyanimide）的化合物结构作为潜在的DUB抑制剂战位（warhead），因其具有独特的化学特性，能够在细胞环境中保持较高的稳定性，并且对特定DUBs表现出良好的选择性。

为了验证该化合物的潜力，研究团队首先在实验室规模下合成并测试了多种氰酰胺结构的化合物，发现其中一些对USP30和UCHL1等DUBs具有显著的抑制活性。然而，对于某些DUBs，如mUSP18（一种主要针对ISG15的去ISGylation酶），此前尚未有有效的特异性抑制剂被报道。因此，研究者决定利用Echo声波液体处理系统，构建一个包含7536种氰酰胺化合物的化合物库，并在1536孔板中直接进行高通量筛选。这一策略的优势在于，能够通过微型化反应减少试剂用量，同时通过自动化操作提高实验效率。在筛选过程中，研究人员使用了荧光基质法检测化合物对12种DUBs和Ub-like蛋白酶的抑制效果，最终从库中筛选出两个具有结构相似性且对mUSP18表现出高度选择性的化合物。

进一步的实验表明，这两个化合物在体外具有显著的抑制活性，并且在细胞水平上也表现出良好的靶向能力。其中，化合物BB07CA902被优化为一种具有35纳摩尔（nM）效力的mUSP18特异性抑制剂。该化合物不仅在41种DUBs中表现出高度选择性，还能在细胞内有效提高ISGylation水平，从而验证了其在细胞内的活性。ISGylation是一种类似于泛素化的可逆过程，通过ISG15修饰靶蛋白，参与宿主对抗病毒的免疫反应。因此，针对mUSP18的抑制剂可能成为抗病毒药物开发的有力工具。

为了进一步确认BB07CA902的特异性，研究人员进行了多方面的实验验证。其中包括通过质谱分析确认其与mUSP18形成共价复合物的能力，以及利用酶动力学参数评估其抑制机制。此外，通过活性基团蛋白检测（Activity-Based Protein Profiling, ABPP）技术，研究人员在活细胞中验证了该化合物对mUSP18的靶向能力，并排除了其对其他DUBs的非特异性抑制。结果显示，BB07CA902在细胞内对mUSP18具有显著的抑制作用，而对其他DUBs的抑制则微乎其微。同时，该化合物在细胞内表现出良好的渗透性，能够有效进入细胞并发挥其生物活性。

除了对mUSP18的抑制作用，研究人员还关注了该化合物对USP18的非酶促功能的影响。USP18不仅是去ISGylation酶，还在细胞信号传导中扮演重要角色，通过与STAT2蛋白形成复合物，调控I型干扰素（IFN）信号通路。利用NanoBRET技术，研究团队发现BB07CA902能够有效抑制mUSP18与ISG15的相互作用，但对mUSP18与STAT2的结合影响较小。这一结果表明，BB07CA902主要通过共价方式抑制mUSP18的酶活性，而不会干扰其在细胞信号传导中的非酶促功能。此外，研究团队还测试了该化合物对p53-MDM2等非靶向蛋白对的相互作用，以确保其作用的特异性，并通过细胞活力实验确认了BB07CA902对细胞无毒性。

在细胞实验中，研究人员进一步评估了BB07CA902对ISGylation的影响。他们发现，该化合物在IFN-β刺激的EL4细胞中能够显著提高ISGylation水平，而对非靶向的USP18则没有明显作用。这一结果不仅验证了BB07CA902对mUSP18的特异性，也说明了其在细胞水平上的生物活性。此外，研究团队还通过动物实验探讨了BB07CA902在体内对ISG15- ISGylation网络的调控作用，发现其在乳腺癌模型中具有潜在的肿瘤抑制作用。这些发现表明，BB07CA902不仅是一种高效的mUSP18抑制剂，还可能成为抗病毒和抗肿瘤药物开发的重要候选分子。

研究团队还探讨了该合成策略的可扩展性。由于Echo声波液体处理系统能够快速、精确地进行微小体积的液体转移，这一技术可以被广泛应用于其他靶点的化合物库构建，如针对其他DUBs或Ub-like蛋白酶的抑制剂筛选。此外，通过调整合成过程中使用的胺类和羧酸类底物，可以轻松扩展库的规模，从而为未来药物发现项目提供更多选择。这一策略的灵活性和高效性使其成为构建和筛选高质量化合物库的有力工具。

总的来说，这项研究展示了一种基于声波液体处理技术的高通量合成与筛选一体化方法，能够快速生成大量针对DUBs的化合物，并直接用于高通量筛选。通过优化反应条件和筛选策略，研究团队成功开发出一种针对mUSP18的高选择性、强效的抑制剂，为抗病毒和抗肿瘤药物的开发提供了新的思路。该方法不仅提高了药物研发的效率，还为后续的化合物优化和功能研究奠定了坚实的基础。未来，随着更多DUBs的发现和研究，这一技术有望在药物开发领域发挥更大的作用，为精准靶向治疗提供新的解决方案。