衰老通过乙酰化MCU介导的钙摄取促进氧化mtDNA诱导巨噬细胞焦亡从而加剧肝脏缺血再灌注损伤

本文针对肝移植中老年供肝更易发生缺血再灌注损伤(IRI)的临床难题，揭示了衰老通过线粒体钙单向转运蛋白(MCU)乙酰化促进钙离子摄取，诱导线粒体通透性转换孔(mPTP)通道开放，导致氧化线粒体DNA(Ox-mtDNA)释放至胞质，进而激活巨噬细胞焦亡的关键机制。研究阐明了老年供肝IRI加重的分子通路，为改善老年供肝移植预后提供了新的理论依据和治疗靶点。

　　

随着终末期肝病患者数量的不断增加，肝移植已成为挽救生命的重要治疗手段。然而，供体肝脏的严重短缺成为制约临床应用的瓶颈问题。在这一背景下，老年供体（年龄>60岁）逐渐成为肝移植的重要来源。但令人困扰的是，老年供肝在移植过程中更容易发生缺血再灌注损伤(Ischemia-Reperfusion Injury, IRI)，导致移植后长期存活率显著降低。据统计，70岁以上供肝的1年移植存活率仅为61-76%，远低于40岁以下供肝的85-86%。这种与年龄相关的肝脏IRI敏感性增加现象背后的分子机制尚不完全清楚，探索这一问题对于提高老年供肝移植成功率具有重要临床意义。

在这项发表于《Cell Death Discovery》的研究中，研究人员通过构建年轻和老年小鼠肝脏缺血90分钟再灌注6或24小时模型，发现老年肝脏在IRI后功能恢复明显延迟。通过深入探索，研究团队揭示了一个全新的分子机制：衰老通过促进线粒体钙单向转运蛋白(MCU)K331位点的乙酰化，增强线粒体对钙离子的摄取，进而诱导线粒体通透性转换孔(mPTP)通道开放，导致氧化线粒体DNA(Ox-mtDNA)释放到细胞质中，最终引发巨噬细胞焦亡(Pyroptosis)，加重肝脏IRI。

研究采用了多种关键技术方法：通过体内小鼠肝脏IRI模型和体外细胞缺氧/复氧(H/R)模型模拟临床病理过程；利用Western blot(WB)、免疫组化(IHC)和共聚焦显微镜等技术检测蛋白表达和定位；采用Co-IP验证蛋白质乙酰化修饰；通过线粒体分离和qPCR分析mtDNA释放情况；使用特异性抑制剂和基因突变体进行功能验证；通过透射电镜(TEM)观察超微结构变化。

研究结果

Aging delayed the recovery of liver function after IRI

研究人员首先检测了年轻和老年小鼠肝脏中衰老标志物P16和P21的表达，发现老年组中这两种蛋白的表达均显著增加。通过建立肝脏IRI模型，发现假手术组中年轻和老年小鼠的ALT和AST水平无显著差异。但在缺血90分钟再灌注6小时后，两组ALT和AST水平均显著升高。有趣的是，再灌注24小时后，年轻组的ALT和AST水平显著下降，而老年组的下降幅度较小。H&E染色结果同样显示，年轻组在再灌注6小时后出现肝窦充血、肝细胞水肿、空泡化和坏死，但在24小时后明显改善；而老年组在再灌注6小时后的肝损伤表型更为严重，且24小时后无明显功能恢复。这些结果表明衰老延迟了IRI后肝功能的恢复。

Aging aggravated macrophage pyroptosis in liver IRI

考虑到衰老与肝脏炎症水平增加和巨噬细胞焦亡诱导相关，研究人员评估了衰老延迟肝脏IRI恢复是否与巨噬细胞焦亡有关。IHC显示再灌注24小时后，老年组非实质细胞中caspase1表达显著增加。TEM进一步观察到老年组巨噬细胞的膜连续性中断、细胞质水肿和细胞器不完整性比年轻组更严重。定量分析线粒体嵴变化发现，老年组的嵴评分相对于年轻组降低。分离各组肝脏巨噬细胞后，发现老年组cleaved-caspase1和GSDMD-N的表达水平高于年轻组。此外，老年组巨噬细胞中caspase-1活性显著升高，进一步促进了LDH、IL-1β和IL-18的分泌和释放。以上结果表明衰老促进了肝脏IRI中的巨噬细胞焦亡，说明巨噬细胞焦亡是衰老延迟肝功能恢复的重要机制。

Aging promoted the release of numerous Ox-mtDNA from mitochondria into the cytoplasm of macrophages

研究表明，由于暴露于高水平的ROS(活性氧)，mtDNA比核DNA更容易受到氧化损伤。Ox-mtDNA泄漏到细胞质中并刺激老年巨噬细胞中caspase1介导的炎症反应。为了验证衰老是否促进巨噬细胞Ox-mtDNA释放，研究人员在再灌注24小时后从年轻和老年组分离肝脏巨噬细胞。结果显示，与年轻组相比，老年组肝脏巨噬细胞的细胞质和线粒体8-OH-dG(DNA氧化损伤标志物)均显著增加，表明mtDNA发生了氧化损伤。老年组巨噬细胞细胞质中mtDNA D-loop、Cox1和Non-NUMT水平较高，表明细胞质mt-DNA增加。

在体外实验中，研究人员用依托泊苷诱导AML12细胞衰老，并检测到P16和P21表达增加。然后将RAW264.7细胞与正常或衰老AML12细胞的上清液共培养，再进行H/R处理。结果显示，老年组细胞质和线粒体8-OH-dG均显著增加，同时细胞质中有更多mtDNA。共聚焦图像显示，与年轻组相比，老年组中dsDNA和Mito-mCherry的共定位缺失更多。这些结果表明衰老促进了mtDNA的氧化损伤，并使其从线粒体释放到巨噬细胞的细胞质中。

Aging induced macrophage pyroptosis by promoting mPTP channel mediated Ox-mtDNA release

mPTP通道位于线粒体膜上，是Ox-mtDNA从线粒体释放到细胞质以激活炎症的关键通道。目前尚不清楚衰老是否通过促进Ox-mtDNA释放而加剧巨噬细胞焦亡。研究人员使用mPTP通道抑制剂环孢素A(CsA)来抑制mPTP通道开放。在H/R期间由衰老微环境诱导的RAW264.7细胞中，钙黄绿素荧光降低，表明mPTP通道开放增加，但CsA阻断了钙黄绿素荧光的降低。为了进一步阐明Ox-mtDNA的释放，检测了mtDNA D-loop、Cox1和Non-NUMT水平以及细胞质中的8-OH-dG。一致地，在用CsA阻断mPTP通道开放后，细胞质Ox-mtDNA减少。共聚焦图像也显示CsA增加了RAW264.7细胞中dsDNA和Mito-mCherry的共定位。此外，CsA降低了由衰老微环境在H/R期间诱导的RAW264.7细胞中cleaved-caspase1和GSDMD-N的表达。而且，用CsA处理后，上清液中的caspase1活性和LDH、IL-1β和IL-18水平显著降低。在形态学上，TEM显示CsA减少了由衰老微环境在H/R期间诱导的RAW264.7细胞的膜连续性中断、细胞质水肿和细胞器不完整性。CsA处理后线粒体嵴评分增加。总之，这些结果表明衰老通过促进mPTP通道开放从而增加Ox-mtDNA的释放来诱导巨噬细胞焦亡。

Aging enhanced MCU-mediated mitochondrial Ca2+ uptake to trigger mPTP channel opening

钙离子(Ca2+)是一种普遍且必需的第二信使，并且是触发mPTP通道开放的关键因素，而不是高水平的ROS。细胞内钙水平主要受内质网(ER)上肌醇1,4,5-三磷酸受体(IP3R)的释放和钙单向转运蛋白(MCU)的摄取，以及细胞膜上瞬时受体电位经典通道(TRPC)通道的外源钙进入的调节。为了初步阐明Ca2+对mPTP通道开放的影响，研究人员使用Ca2+螯合剂BAPTA-AM来抑制由衰老微环境在H/R期间诱导的RAW264.7细胞中的细胞内Ca2+。老年组Fluo4-AM的荧光强度显著降低，表明细胞内Ca2+被螯合。此外，BAPTA-AM阻止了钙黄绿素的荧光淬灭，并降低了细胞质Ox-mtDNA水平。这些结果暗示Ca2+是衰老促进mPTP通道开放的关键因素。

为了进一步阐明线粒体Ca2+的来源，研究人员分别用SKF96365(SKF，一种膜TRPC通道抑制剂)、2-氨基乙基二苯基硼酸酯(2APB，一种内质网IP3R抑制剂)或RU360(一种线粒体MCU抑制剂)处理由衰老微环境在H/R期间诱导的RAW264.7细胞。共聚焦图像显示，老年组Rhod2(代表线粒体Ca2+结合)的荧光强烈升高。有趣的是，用SKF和2APB预处理后没有显著变化。然而，RU360减弱了其荧光。一致地，RU360抑制了mPTP通道的开放并降低了细胞质Ox-mtDNA水平，而SKF和2APB没有显著影响。总之，这些结果表明在衰老微环境中，衰老增加了细胞内Ca2+并促进线粒体MCU摄取Ca2+，从而触发mPTP通道介导的Ox-mtDNA释放。

MCU was acetylated in aging-induced macrophages during H/R

研究人员使用WB检测了在有或没有衰老微环境诱导的H/R期间RAW264.7中MCU的表达，但两组之间没有显著差异。乙酰化是影响蛋白质聚集和蛋白质稳定性的重要蛋白质翻译后修饰(PTMs)之一。鉴于越来越多的证据表明蛋白质乙酰化在衰老中起关键作用，并且线粒体是除细胞核外高度富含乙酰化的细胞器，研究人员使用WB检测了两组全细胞乙酰化。与年轻组相比，老年组的乙酰化水平更高。然后，研究人员使用Co-IP发现，在H/R期间由衰老微环境诱导的RAW264.7中MCU发生乙酰化。进一步使用Phosph-SitePlus和GPS-PAIL网站预测MCU的乙酰化位点为K331。这些结果表明衰老导致H/R期间巨噬细胞中线粒体MCU的乙酰化。

MCU acetylation at K331 was essential for aging promoting mitochondrial Ca2+ uptake, mPTP channel opening and Ox-mtDNA release in macrophages during H/R

为了进一步阐明K331是否是衰老诱导MCU乙酰化促进线粒体Ca2+超载、mPTP通道开放和Ox-mtDNA的位点，研究人员在RAW264.7细胞与正常或衰老AML12细胞上清液共培养并诱导H/R之前，用Lv-MCU-WT或Lv-MCU-K331R感染RAW264.7细胞。Co-IP测试并显示K331突变后MCU去乙酰化。共聚焦图像显示，在H/R期间，young-MCU-MT组和young-MCU-K331R组之间的线粒体Ca2+水平没有显著差异。然而，aging-MCU-K331R组的线粒体Ca2+水平低于aging-MCU-WT组。类似地，与aging-MCU-WT组相比，aging-MCU-K331R组显示钙黄绿素荧光增强和细胞质Ox-mtDNA减少。然而，与young-MCU-WT组相比，young-MCU-K331R组在钙黄绿素增强和细胞质Ox-mtDNA减少方面显示出轻微变化。此外，在衰老诱导的RAW264.7细胞用MCU K331R突变体处理后，dsDNA和线粒体的共定位增加。这些结果表明衰老诱导MCU在K331处乙酰化，导致H/R期间巨噬细胞的线粒体Ca2+超载、mPTP通道开放和Ox-mtDNA释放。

MCU acetylation at K331 was vital for aging facilitating macrophage pyroptosis during H/R

研究人员继续研究MCU K331R突变体对有无衰老微环境诱导的H/R期间巨噬细胞焦亡的影响。WB显示，在年轻组中，MCU K331R的突变仅轻微降低了cleaned-caspase1和GSDMD-N的表达，但在老年组中，MCU K331R的突变显著降低了cleaned-caspase1和GSDMD-N的表达。此外，与年轻组相比，老年组显示用MCU K331突变体处理后，RAW264.7细胞中的caspase1活性、上清液IL1β、IL-18和LDH降低更显著。TEM显示，与年轻组相比，老年组用MCU K331突变体处理后，RAW264.7细胞的水肿、细胞器损伤和细胞膜不完整性减少更显著。此外，在老年组中，用MCU K331突变体处理后，线粒体嵴评分显著增加。简言之，MCU在K331处的乙酰化是衰老在H/R期间诱导巨噬细胞焦亡的重要因素。

研究结论与意义

本研究通过系统的体内外实验证明，衰老通过诱导巨噬细胞焦亡延迟IRI后肝功能恢复。在机制上，研究强调了衰老触发mPTP通道开放以增加Ox-mtDNA释放，从而诱导巨噬细胞焦亡。此外，研究进一步阐明了mPTP通道的活性主要依赖于乙酰化MCU在K331位点的钙摄取。总之，这些结果阐明了细胞质Ox-mtDNA诱导的巨噬细胞焦亡是衰老延迟肝功能恢复的关键因素。通过乙酰化MCU摄取钙触发了mPTP通道开放，这是Ox-mtDNA从线粒体释放到细胞质的重要机制。

这项研究不仅揭示了老年供肝IRI加重的细胞和分子机制，还为临床干预提供了潜在靶点。针对MCU乙酰化、mPTP通道开放或Ox-mtDNA释放的特异性抑制剂可能成为改善老年供肝移植预后的新型治疗策略。此外，该研究为理解衰老相关炎症性疾病提供了新的视角，表明调控线粒体功能可能成为治疗年龄相关疾病的新途径。

研究的发现具有重要的临床转化价值。在肝移植领域，针对MCU乙酰化或mPTP通道的干预措施可能提高老年供肝的移植成功率，缓解供体短缺问题。在更广泛的范围内，这一机制可能适用于其他与年龄相关的器官缺血再灌注损伤，为老年患者的手术治疗和器官保护提供新思路。