NNMT-H3K9me3-ALDH1A3轴调控自噬与孕酮信号：揭示复发性种植失败的表观遗传代谢新机制

本研究针对复发性种植失败（RIF）中子宫内膜容受性缺陷的机制展开探索，发现NNMT（烟酰胺N-甲基转移酶）表达下调通过升高H3K9me3修饰抑制ALDH1A3转录，进而促进自噬并破坏孕酮信号通路。该研究揭示了NNMT-H3K9me3-ALDH1A3轴在RIF中的关键作用，为临床诊断和治疗提供了新靶点。

　　

在辅助生殖技术日益普及的今天，复发性种植失败（RIF）仍是困扰临床医师和患者的难题。尽管多次移植高质量胚胎，仍有约10%的患者无法获得临床妊娠。子宫内膜容受性缺陷被认为是导致RIF的重要因素，但其具体调控机制尚不明确。子宫内膜容受性是指子宫内膜在特定植入窗口期内接受胚胎着床的能力，涉及复杂的形态和功能变化，受到卵巢雌激素、孕酮以及多种转录因子、细胞因子和信号通路的精密调控。近年来，自噬（autophagy）作为一种重要的细胞降解过程，被发现在维持子宫内膜稳态和正常妊娠中扮演关键角色。然而，自噬水平异常究竟如何影响子宫内膜容受性，其分子机制仍有待阐明。

与此同时，烟酰胺N-甲基转移酶（NNMT）作为一种重要的甲基转移酶，在人类子宫内膜组织中高表达，但其在子宫内膜容受性和RIF发病机制中的作用尚未明确。NNMT使用S-腺苷甲硫氨酸（SAM）作为甲基供体，催化烟酰胺和其他吡啶衍生物的甲基化，参与烟酰胺、药物和外源化合物的生物转化，维持代谢和能量平衡。异常NNMT表达已被证明可通过破坏细胞自噬参与癌症、神经系统疾病和肥胖的发生发展。

在这项发表于《Cell Death Discovery》的研究中，研究人员通过多种技术方法揭示了NNMT在RIF中的关键作用。研究团队收集了RIF患者和生育能力正常对照者的中期黄体期子宫内膜样本，使用qPCR和免疫组化分析NNMT表达差异；利用永生化人子宫内膜基质细胞系（THESCs）和原代人子宫内膜基质细胞（ESCs）进行体外功能实验，通过RNA干扰技术敲低NNMT和ALDH1A3基因表达；采用免疫印迹、mCherry-eGFP-LC3荧光自噬实验评估自噬水平变化；通过RNA测序分析转录组差异；运用CUT&RUN技术检测H3K9me3与ALDH1A3启动子区域的结合情况；并建立小鼠模型进行体内功能验证。

NNMT表达水平在RIF患者中期黄体期子宫内膜中低但在蜕膜化过程中增加

研究人员首先通过qPCR验证了15例对照患者和20例RIF患者中期黄体期子宫内膜样本中NNMT的表达情况。结果显示，与生育能力正常的女性相比，RIF患者的NNMT水平显著降低。随后，他们通过对12例对照患者和11例RIF患者的子宫内膜组织进行免疫组化染色，验证了NNMT蛋白水平的差异。为研究NNMT在ESCs蜕膜化过程中的表达，研究人员从蜕膜化和未处理的THESCs中提取了D2、D4和D6时间点的mRNA和蛋白质。免疫印迹和qPCR分析显示，NNMT水平在蜕膜化后增加，D4时的差异最为明显。

NNMT敲低促进自噬并损害蜕膜过程中的孕酮信号

为研究NNMT在人ESCs中的作用，研究人员设计了两条siRNA（siNNMT-47和siNNMT-216）。转染后验证了THESCs中的敲低效率，结果显示NNMT RNA和蛋白水平显著降低。为确定NNMT敲低对ESCs功能的影响，研究人员测量了THESCs和HESCs中蜕膜化诱导D4时蜕膜化标志物PRL和IGFBP1以及与孕酮信号通路相关的PGR、HOXA10和HAND2的mRNA水平。结果显示，与阴性对照组相比，敲低组中PGR、HOXA10和HAND2水平显著降低，而PRL和IGFBP1水平在组间相似，表明NNMT敲低损害了ESCs中的孕酮信号，但不影响cAMP介导的蜕膜化通路。

此外，研究人员检测了NNMT敲低后基质细胞自噬流的变化。在THESCs和HESCs中NNMT敲低和蜕膜化诱导4天后，联合使用或不使用自噬抑制剂巴佛洛霉素A（BafA1），通过免疫印迹检测自噬标志物LC3B和P62。结果显示，无论是否经过BafA1处理，NNMT敲低后P62表达水平降低，而LC3B II表达水平在THESCs和HESCs中均增加。mCherry-eGFP-LC3腺病毒感染和共聚焦显微镜观察THESCs中的自噬体，与免疫印迹结果一致，NNMT敲低细胞中出现了更多的LC3斑点。

NNMT敲低通过增加H3K9me3水平抑制ALDH1A3的转录

为检查人基质细胞中NNMT的潜在分子靶点，研究人员使用RNA测序分析了蜕膜化状态下NNMT敲低THESCs的转录组。基于测序数据分析，ALDH1A3在NNMT敲低后显著下调，该基因编码一种视黄醛代谢酶，对视黄酸生物合成至关重要，与干细胞分化和氧化应激反应有关，因此与癌症和代谢紊乱相关。通过qPCR和免疫印迹在NNMT敲低后的THESCs和HESCs中验证了ALDH1A3的表达。

NNMT催化SAM的甲基基团不可逆地转移至烟酰胺，从而改变多种代谢过程，如甲硫氨酸循环、染色质重塑和组蛋白（包括H3K9）甲基化。因此，研究人员进一步研究了NNMT敲低对H3K9me3水平的影响。免疫印迹结果显示，与阴性对照组相比，蜕膜化D4时NNMT敲低组中的H3K9me3水平增加。

考虑到启动子区域的H3K9me3修饰通常会抑制靶基因的转录，研究人员假设NNMT敲低可能通过增加H3K9me3水平来抑制ALDH1A3转录。他们在ENCODE数据库中发现ALDH1A3启动子区域存在H3K9me3修饰位点，支持上述假设。进一步通过CUT&RUN实验监测NNMT敲低后H3K9me3与ALDH1A3基因启动子区域的相互作用，发现NNMT敲低导致ALDH1A3启动子区域H3K9me3富集增加。

ALDH1A3介导NNMT诱导的自噬和蜕膜化

为进一步研究ALDH1A3在人ESCs中的作用，研究人员设计了一条siRNA（siALDH1A3）并在RNA和蛋白水平验证了其敲低效率。转染和体外蜕膜化诱导4天后，ALDH1A3敲低降低了THESCs和HESCs中PGR、HOXA10和HAND2的表达水平，而不改变PRL或IGFBP1的表达水平，这与NNMT降低的效果一致。类似地，ALDH1A3敲低抑制了p62的表达并促进了LC3BII在THESCs和HESCs中的表达，mCherry-eGFP-LC3荧光实验显示ALDH1A3敲低后THESCs中自噬体数量增加，BafA1处理4小时后自噬流被抑制。

研究人员进一步研究了补充外源性人重组ALDH1A3（rhALDH1A3）是否能够挽救NNMT下调后THESCs和HESCs中的自噬和孕酮信号。结果显示外源性rhALDH1A3改善了siNNMT降低的THESCs和HESCs中的孕酮信号。此外，Western印迹和mCherry-eGFP-LC3荧光实验表明，在NNMT敲低和诱导蜕膜化的细胞中，添加rhALDH1A3部分挽救了自噬。

NNMT抑制损害小鼠胚胎植入

为探索NNMT敲低对体内胚胎植入的影响，研究人员使用野生型C57BL/6小鼠，通过在GD4.5时单侧子宫角注射选择性NNMT抑制剂或空白溶剂，分别创建子宫NNMT失活组（NNMTi组）和对照组。在GD5.5时处死孕鼠，使用芝加哥蓝染料溶液观察和记录植入位点。结果显示，与对照组相比，NNMTi组的植入位点显著减少。此外，通过qPCR和免疫印迹实验观察到NNMTi组中ALDH1A3表达水平降低。

研究结论与讨论部分指出，子宫内膜容受性的建立对RIF的发病机制起着至关重要的作用，但其分子机制仍 largely 未知。本研究结果表明，RIF患者中期黄体期子宫内膜中NNMT表达水平降低，通过H3K9me3-ALDH1A3通路干扰孕酮信号并促进ESCs自噬，最终损害子宫内膜容受性并导致RIF。

NNMT是一种甲基转移酶，利用SAM作为甲基供体催化烟酰胺（NAM）的甲基化，将单碳代谢与细胞甲基化稳态和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）直接联系起来。先前研究表明，与增殖期子宫内膜相比，NNMT在分泌中期子宫内膜中的表达上调，同时发现NNMT受孕酮调控，其在RIF患者子宫内膜中的表达显著下调。NNMT的减少可以区分生育女性和RIF女性分泌中期的子宫内膜。

自噬是真核细胞中普遍存在的分解代谢过程，在细胞、组织和有机体的稳态中发挥重要作用。许多研究证实了自噬在肿瘤形成中的作用，而胚胎侵入子宫的过程与肿瘤发生有一些相似之处。先前研究发现，自噬参与植入前后正常子宫内膜功能的维持，在子宫内膜容受性、基质细胞蜕膜化和胚胎植入中发挥重要作用。然而，关于自噬水平升高或降低是否导致RIF仍存在争议。自噬缺陷会破坏细胞代谢稳态，而自噬过度会导致必需细胞成分不受控制的自我消化，最终引发自噬性细胞死亡和组织损伤。

本研究还发现NNMT水平降低影响ESCs中的孕酮信号并损害子宫内膜容受性。子宫内膜容受性发生在排卵后6-10天，受雌激素和孕酮调控。孕酮信号在正常妊娠建立中的作用已被深入研究。PGR及其下游靶点HOXA10和HAND2等分子对ESCs的蜕膜化和容受性子宫内膜的形成至关重要。

ALDH1A3编码一种醛脱氢酶，对视黄酸生物合成至关重要，与干细胞分化和氧化应激反应有关，并与癌症和代谢紊乱相关。先前研究报道ALDH1A3在多种恶性肿瘤中异常表达，且与代谢密切相关。此外，有研究报道在ICSI周期后成功妊娠的患者与至少两个ICSI周期后未妊娠的患者之间，子宫内膜容受期ALDH1A3表达水平存在显著差异。本研究结果揭示了ALDH1A3通过其對自噬和蜕膜化过程的调节作用参与子宫内膜容受性的调控，为其在植入窗口期的调节作用提供了新的见解。

考虑到NNMT是一种重要的甲基转移酶，其表达水平的变化可能导致SAM的甲基基团或多或少地用于靶分子（如组蛋白或DNA）的甲基化。先前研究表明，NNMT的高表达水平会消耗过多的活性甲基基团，导致E-钙黏蛋白启动子的H3K4me3修饰减少和E-钙黏蛋白mRNA的m⁶A修饰抑制，从而在转录和转录后水平抑制E-钙黏蛋白的表达。此外，有研究发现NNMT水平降低会引发甲基基团过量，导致细胞外基质相关基因启动子处的组蛋白H3K9三甲基化和DNA甲基化增加。同时，多位学者已经证明ALDH1A3的转录可以通过其启动子区域的H3K27ac激活并被H3K9me3抑制，这与本研究结果一致。

总之，本研究从体外和体内研究的结果表明，RIF患者中期黄体期子宫内膜中NNMT水平降低通过H3K9me3-ALDH1A3通路干扰孕酮信号并促进ESCs自噬，最终损害子宫内膜容受性并导致RIF。这些发现从自噬和表观遗传角度丰富了我们对RIF病因机制的认识，为预测子宫内膜容受性提供了新的靶点，对RIF的精准防治和提高IVF成功率具有重要意义。