miR-140-3p通过调控轴突运动蛋白KIF5A介导脊髓性肌萎缩症轴突运输退化机制研究

本研究针对脊髓性肌萎缩症(SMA)中运动神经元选择性退化的分子机制未阐明问题，开展了KIF5A轴突运输调控机制研究。发现KIF5A在SMA小鼠脊髓中特异性下调，miR-140-3p通过靶向KIF5A 3'UTR负向调控其表达，使用AntimiR-140-3p干预可改善运动行为表现。该研究揭示了轴突运输障碍在SMA中的关键作用，为开发新型治疗策略提供了靶点。

　　

在儿科神经肌肉疾病领域，脊髓性肌萎缩症(Spinal Muscular Atrophy, SMA)始终是导致婴儿死亡的最常见遗传原因。这种疾病主要由生存运动神经元(Survival Motor Neuron, SMN)基因的突变引起，导致运动神经元(Motor Neurons, MNs)进行性退化。尽管近年来针对SMA患者的治疗手段如Nusinersen、Risdiplam和Onasemnogene abeparvovec等相继获批，但这些治疗方法仍存在治疗窗口窄、疗效有限以及组织特异性靶向等问题。更重要的是，导致运动神经元选择性退化的分子通路尚未完全阐明，这成为SMA研究领域亟待解决的核心问题。

值得注意的是，轴突运输障碍是运动神经元疾病(Motor Neuron Diseases, MNDs)的一个共同特征，其中驱动蛋白(kinesin)家族在运输机制中扮演关键角色。特别是kinesin 1超家族成员KIF5A，其C末端的突变已被发现与肌萎缩侧索硬化症(Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS)等神经退行性疾病相关。KIF5A作为神经元中最重要的驱动蛋白之一，负责介导沿着微管向轴突末端的顺向运输，承载着包括神经丝、RNA颗粒、溶酶体、淀粉样前体蛋白(APP)囊泡和线粒体等重要货物的运输任务。

在这项发表于《Cell Death Discovery》的研究中，研究人员利用SMNΔ7小鼠模型，首次揭示了KIF5A在SMA发病机制中的关键作用。他们发现KIF5A在疾病早期和晚期都在SMA小鼠脊髓中特异性下调，而这种下调与miR-140-3p的表达上调密切相关。通过开发基于miRNA的治疗策略，研究人员证明使用AntimiR-140-3p能够恢复KIF5A的生理水平，显著改善SMA小鼠的运动行为表现。

研究采用了多种关键技术方法：使用SMNΔ7转基因小鼠模型进行在体实验；通过Western blot和qPCR分析蛋白和mRNA表达水平；利用免疫荧光和共聚焦显微镜进行组织定位分析；采用生物信息学工具预测miRNA靶点；通过细胞转染和双荧光素酶报告基因验证miRNA与靶基因的相互作用；进行脑室内注射给药；运用右翻反射、负向趋地性和尾悬试验等行为学测试评估运动功能。

研究人员首先检测了KIF5A在SMA小鼠不同中枢神经系统区域的表达情况。Western blot分析显示，在疾病早期(P5)和晚期(P11)，KIF5A蛋白水平在SMA小鼠脊髓中均显著下调约50%，而在前额皮层和脑干中未观察到显著变化。有趣的是，qPCR分析表明这种下调并非发生在转录水平，提示存在转录后调控机制。

为了验证KIF5A下调是否影响其参与的轴突运输蛋白质相互作用，研究人员检测了MIRO1、TRAK1和TRAK2的表达水平。令人惊讶的是，这些蛋白在SMA小鼠脊髓中的表达均未发生显著变化，其转录水平也保持稳定，表明KIF5A的下调是特异性的，而非整个轴突运输复合体的普遍改变。

通过免疫荧光实验，研究人员进一步证实了KIF5A在神经元中的定位。共聚焦显微镜观察显示，在疾病晚期(P11)，SMA小鼠脊髓中神经元标记物NeuN和KIF5A双阳性细胞数量显著减少。与胶质细胞标记物GFAP或IBA1的共定位实验显示KIF5A仅特异性表达于神经元，这与先前报道一致。

为了探索恢复KIF5A水平的神经保护策略，研究人员通过TargetScan软件分析了Kif5A基因3'UTR区域的潜在miRNA靶点。发现了miR-17-5p、miR-20-5p、miR-103-3p、miR-140-3p和miR-16-5p等多个高度保守的miRNA结合位点。初步筛选显示，只有miR-140-3p在SMA小鼠脊髓中显著上调6.3倍。

通过体外实验，研究人员证实了miR-140-3p对KIF5A的调控作用。在SH-SY5Y细胞中转染miR-140模拟物可导致KIF5A蛋白水平显著下调40%。双荧光素酶报告基因实验进一步证明，miR-140-3p能够特异性结合Kif5A 3'UTR的+78/84 bp位置，突变该结合位点后则消除了这种调控作用。

为了在体内恢复KIF5A水平，研究人员通过脑室内注射给予能够特异性阻断miR-140-3p功能的AntimiR分子。实验动物被随机分为四组：WT+NT-AntimiR、WT+AntimiR、SMA+NT-AntimiR和SMA+AntimiR。

行为学评估显示，AntimiR处理显著改善了SMA小鼠的运动表现。在右翻反射测试中，SMA+AntimiR组从P6开始表现出显著改善；在负向趋地性测试中，处理组在P10和P11的表现明显优于对照组；在尾悬试验中，AntimiR处理组后肢姿势评分显著提高。然而，AntimiR处理并未显著改善SMA小鼠的体重和生存期，表明单独靶向轴突运输可能不足以完全抵消SMN缺陷的影响。

研究

研究结论与讨论部分强调，该研究首次在SMNΔ7小鼠模型中证实了线粒体运输驱动蛋白KIF5A在SMA疾病进展过程中在脊髓中显著减少，且这种减少与miR-140-3p的上调平行发生。通过脑室内注射AntimiR-140-3p能够改善SMA小鼠的行为表现。

轴突运输缺陷在运动神经元疾病中扮演关键作用，KIF5A作为轴突运输机制的主要组成部分，已与ALS和遗传性痉挛性截瘫等多种运动神经元疾病相关联。本研究发现在SMA小鼠脊髓中，KIF5A蛋白水平在疾病早期和晚期均下调，而轴突运输复合体的其他成员（MIRO1、TRAK1和TRAK2）表达未发生改变，这表明轴突运输障碍可能是由于KIF5A与MIRO1和/或其他适配器蛋白的复合物丢失所致。

研究人员提出了一个有趣的假设：SMN可能是KIF5A的新货物。这一假设基于两个主要原因：首先，SMN以符合快速轴突运输的速度沿着轴突主动运输；其次，在已知存在轴突运输损伤和KIF5A减少的SOD1和TDP-43小鼠模型中，SMN过表达导致其核周积累，限制了其对表型的有益作用。如果这一假设得到证实，不仅有助于理解SMN的轴突功能以及轴突RNA运输和局部翻译缺陷在SMA中的作用，也对其他运动神经元疾病具有重要意义。

该研究的重要意义在于揭示了KIF5A在运动神经元疾病中作为治疗和诊断工具的核心作用，开发能够预防KIF5A下调的策略可能不仅对SMA有益，也对其他神经退行性疾病具有治疗价值。目前可用的SMN提升策略为研究通过KIF5A恢复SMN的运输和轴突定位是否对SMA和其他运动神经元疾病有益提供了新的研究方向。

总之，这项研究为理解SMA的分子机制提供了重要见解，揭示了miR-140-3p/KIF5A轴在疾病进展中的关键作用，为开发新的治疗策略奠定了理论基础。同时，该研究也强调了轴突运输障碍在神经退行性疾病中的普遍重要性，为相关疾病的研究提供了新的思路和方向。