海马体CaMKII-αβ-羟基丁酰化诱导1型糖尿病小鼠记忆缺陷

《Communications Biology》：Hippocampal CaMKII-α β-hydroxybutyrylation induces memory deficits in mice with type 1 diabetes mellitus

1型糖尿病（T1DM）常伴随认知功能障碍，但其机制尚不明确。本研究揭示了高浓度β-羟基丁酸（β-OHB）通过促进海马体钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II-α（CaMKII-α）在K42和K267位点的β-羟基丁酰化（kbhb），抑制CaMKII活性，进而导致突触可塑性受损和记忆缺陷。该研究为糖尿病相关认知障碍提供了新的代谢调控机制，并提示抑制CaMKII-α kbhb是潜在的治疗靶点。

　　

论文解读

在1型糖尿病（T1DM）的诸多并发症中，认知功能下降和记忆障碍是严重影响患者生活质量的问题。尽管高血糖被认为是导致脑损伤的主要原因，但其背后具体的分子机制仍是一个未解之谜。在糖尿病状态下，由于胰岛素绝对缺乏，机体会启动酮体生成，其中β-羟基丁酸（β-OHB）是含量最丰富的酮体，在糖尿病酮症酸中毒中扮演着关键角色。有趣的是，β-OHB不仅是能量底物，近年来还被发现可以作为“供体”，在组蛋白上诱导一种名为“β-羟基丁酰化（kbhb）”的翻译后修饰，从而调控基因表达。那么，在1型糖尿病的大脑中，高水平的β-OHB是否也会通过类似的修饰来影响记忆相关的关键蛋白，最终导致记忆缺陷呢？这正是本研究试图回答的核心问题。

为了回答这个问题，研究人员将目光投向了海马体——大脑中负责学习和记忆的关键区域。在这里，钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II-α（CaMKII-α）是形成记忆所必需的“明星”蛋白。当CaMKII-α被激活后，它能促进神经元之间的连接增强，即长时程增强（LTP），这是记忆形成的细胞基础。因此，任何抑制CaMKII-α活性的因素都可能导致记忆障碍。

本研究发表在《Communications Biology》上，旨在探究高水平的β-OHB是否通过促进海马体CaMKII-α的β-羟基丁酰化，从而抑制其活性，最终导致1型糖尿病小鼠出现记忆缺陷。

关键技术方法

本研究主要采用了以下关键技术方法：1. 动物模型构建：使用链脲佐菌素（STZ）诱导雄性C57BL/6J小鼠建立1型糖尿病模型，并通过腹腔注射β-OHB建立高酮体模型。2. 行为学测试：通过Y迷宫、新物体位置识别、新物体识别和情境恐惧条件反射等实验评估小鼠的工作记忆、空间记忆和长时程记忆。3. 分子生物学技术：利用特异性抗体通过蛋白质印迹（Western Blot）检测CaMKII-α在K42和K267位点的β-羟基丁酰化水平；使用酶活性检测试剂盒测定CaMKII和组蛋白去乙酰化酶（HDAC）的活性。4. 病毒载体技术：通过腺相关病毒（AAV）在体过表达野生型或突变型（K42M和K267A）CaMKII-α，以及利用短发夹RNA（shRNA）敲低P300，以验证特定分子在记忆缺陷中的作用。5. 电生理学记录：在离体海马脑片上记录配对脉冲易化（PPF）和长时程增强（LTP），以评估突触可塑性。6. 分子动力学（MD）模拟：基于CaMKII-α全酶结构，模拟β-羟基丁酰化对蛋白质构象和关键残基（如T286）溶剂可及表面积（SASA）的影响。

研究结果

高水平的β-OHB促进T1DM小鼠海马体CaMKII-α的β-羟基丁酰化

研究人员首先成功构建了1型糖尿病小鼠模型，并证实了这些小鼠不仅血糖升高，其肝脏、血液和海马体中的β-OHB水平也显著增加。更重要的是，随着时间推移，海马体中β-OHB的浓度持续升高。为了验证β-OHB是否能够诱导CaMKII-α发生β-羟基丁酰化，他们使用了特异性抗体，发现T1DM小鼠海马体中CaMKII-α在K42和K267位点的β-羟基丁酰化水平也显著增加，且这种增加具有时间依赖性。这些结果表明，在T1DM状态下，海马体中高水平的β-OHB确实促进了CaMKII-α的β-羟基丁酰化。

T1DM小鼠表现出记忆缺陷，并伴有CaMKII活性降低

接下来，研究人员通过一系列行为学测试评估了T1DM小鼠的记忆功能。结果发现，与对照组相比，T1DM小鼠在Y迷宫、新物体位置识别、新物体识别和情境恐惧条件反射测试中均表现出明显的记忆障碍。同时，他们发现T1DM小鼠海马体的组蛋白去乙酰化酶（HDAC）活性并未改变，但CaMKII的活性却显著降低。这提示，高水平的β-OHB可能并非通过抑制HDAC来影响记忆，而是通过促进CaMKII-α的β-羟基丁酰化，进而抑制其活性，最终导致记忆缺陷。

高水平的β-OHB通过促进CaMKII-α β-羟基丁酰化来损害记忆

为了直接证明β-OHB是导致记忆缺陷的“元凶”，研究人员直接给正常小鼠注射β-OHB，使其血液和海马体中的β-OHB水平升高。与T1DM小鼠类似，这些小鼠也表现出了记忆障碍。更重要的是，这些小鼠的海马体同样出现了CaMKII-α在K42和K267位点的β-羟基丁酰化水平升高，以及CaMKII活性降低。然而，海马体的HDAC活性和组蛋白乙酰化水平并未改变。这些结果有力地证明，高水平的β-OHB确实是通过促进CaMKII-α的β-羟基丁酰化，而非通过抑制HDAC，来抑制CaMKII活性并损害记忆的。

高水平的β-OHB损害海马体突触功能

CaMKII活性对于维持突触可塑性至关重要。为了探究β-OHB如何影响突触功能，研究人员在离体海马脑片上进行了电生理记录。他们发现，β-OHB处理的小鼠海马体CA1区的配对脉冲易化（PPF）显著降低，表明短时程突触可塑性受损。更重要的是，由theta节律爆发刺激（TBS）诱导的长时程增强（LTP）的诱导和维持也均显著受损。这些结果从突触层面揭示了β-OHB导致记忆缺陷的细胞机制。

海马体CA1区CaMKII-α的β-羟基丁酰化参与T1DM小鼠的记忆缺陷

为了进一步确认CaMKII-α的β-羟基丁酰化是导致记忆缺陷的关键环节，研究人员在海马体CA1区过表达了野生型CaMKII-α或突变型CaMKII-α（K42M和K267A，即不能被β-羟基丁酰化的突变体）。结果发现，在T1DM小鼠中，过表达野生型CaMKII-α会进一步加重记忆缺陷；而过表达突变型CaMKII-α则能显著改善记忆。在电生理实验中，过表达野生型CaMKII-α会进一步加剧β-OHB引起的PPF和LTP损伤，而过表达突变型CaMKII-α则能逆转这些损伤。这些结果强有力地证明，CaMKII-α在K42和K267位点的β-羟基丁酰化是介导T1DM小鼠记忆缺陷的关键分子事件。

β-OHB通过K42和K267位点的β-羟基丁酰化抑制海马体CaMKII活性

在体外细胞实验中，研究人员发现β-OHB处理能直接增加HT22细胞中CaMKII-α在K42和K267位点的β-羟基丁酰化，并降低CaMKII活性。而过表达突变型CaMKII-α则能阻断β-OHB对CaMKII活性的抑制作用。此外，他们发现乙酰转移酶P300是催化CaMKII-α发生β-羟基丁酰化的关键酶。使用P300抑制剂A485或利用shRNA敲低P300，均能逆转β-OHB引起的CaMKII-α β-羟基丁酰化水平升高和CaMKII活性降低。在体实验中，在海马体CA1区敲低P300，不仅能降低CaMKII-α的β-羟基丁酰化水平、提高CaMKII活性，还能显著改善T1DM小鼠的记忆缺陷。

分子动力学模拟揭示K42和K267位点β-羟基丁酰化影响CaMKII活性的潜在机制

为了从原子层面理解β-羟基丁酰化如何影响CaMKII的活性，研究人员进行了分子动力学模拟。他们发现，与野生型CaMKII-α相比，发生β-羟基丁酰化的CaMKII-α整体构象的灵活性显著增加。更重要的是，β-羟基丁酰化使得关键的自磷酸化位点T286的溶剂可及表面积（SASA）减小，这意味着T286更不容易暴露在溶剂中，从而不利于其发生自磷酸化。此外，K42是ATP结合口袋中的关键保守残基，其侧链的修饰会改变ATP的结合，从而影响酶的催化活性。这些模拟结果从结构上解释了β-羟基丁酰化抑制CaMKII活性的分子机制。

研究结论与意义

本研究揭示了1型糖尿病导致记忆缺陷的一种全新机制：高水平的β-羟基丁酸（β-OHB）作为β-羟基丁酰基供体，在乙酰转移酶P300的催化下，促进了海马体钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II-α（CaMKII-α）在K42和K267位点的β-羟基丁酰化。这种修饰通过增加蛋白质构象的灵活性，干扰了ATP结合和关键残基T286的自磷酸化，从而抑制了CaMKII的活性。CaMKII活性的降低进一步损害了海马体的突触可塑性（包括短时程和长时程增强），最终导致记忆功能障碍。

这项研究的意义在于，它首次将代谢物β-OHB、蛋白质翻译后修饰（β-羟基丁酰化）和1型糖尿病的认知功能障碍联系起来，为理解糖尿病相关脑损伤的分子机制提供了新的视角。更重要的是，该研究指出，抑制CaMKII-α的异常β-羟基丁酰化，或者使用不能被该修饰的突变型CaMKII-α，能够有效改善记忆缺陷。这为开发针对糖尿病诱导的认知障碍的潜在治疗策略提供了新的靶点。