单细胞转录组揭示HFpEF与HFrEF心肌细胞异质性及脂肪酸代谢紊乱新机制

《Communications Biology》：Single-cell transcriptomic profiling reveals cell type heterogeneity between HFpEF and HFrEF

本研究针对射血分数保留型心衰(HFpEF)与射血分数降低型心衰(HFrEF)细胞异质性差异不明的难题，通过构建包含21,747个小鼠心脏细胞的单细胞图谱，首次发现心肌细胞(CMs)而非内皮细胞或成纤维细胞是HFpEF中细胞间通讯的主导枢纽。研究鉴定出HFpEF特异的心肌细胞亚群CM3，其特征为脂肪酸代谢相关基因显著高表达；调控网络分析揭示Ppargc1a、Atf6等转录因子在HFpEF中特异性激活；整合GWAS和eQTL数据进一步定位了心衰易感基因的细胞类型特异性功能。该研究为理解HFpEF独特病理机制及开发细胞类型特异性疗法提供了新视角。

　　

在心血管疾病领域，心力衰竭（Heart Failure, HF）是一个全球性的健康挑战，影响着全球超过6400万人。根据左心室射血分数（Ejection Fraction, EF）的不同，心衰主要分为两种类型：射血分数保留的心衰（HFpEF，EF≥50%）和射血分数降低的心衰（HFrEF，EF<40%）。尽管HFrEF的病理机制，如交感神经系统和肾素-血管紧张素-醛固酮系统的激活，已被广泛研究并有了相对有效的靶向药物，但HFpEF的病理生理学机制却复杂得多，被认为是一种具有高度异质性的多系统疾病，同时影响心脏、血管、肺、骨骼肌等多个器官，目前尚无有效的治疗方法。多年来，HFpEF曾被视为HFrEF的早期阶段，然而多项针对HFrEF的临床试验（如TOPCAT、PARAGON-HF等）在HFpEF患者中均未能取得理想结果，这促使研究人员认识到HFpEF是一个独立的疾病实体，亟需深入探索其独特的发病机制。

心脏移植在HFpEF患者中很少进行，且原位心脏活检在全球范围内也极为有限，这导致来自活体心肌细胞（Cardiomyocytes, CMs）的患者组织数据极其匮乏。动物模型，特别是通过高脂饮食联合一氧化氮合酶抑制剂（如L-NAME）诱导的HFpEF小鼠模型，成为模拟人类HFpEF多系统特征的重要工具。单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术的出现为在单细胞水平探索基因表达提供了强大手段，但传统基于液滴的方法难以有效捕获体积巨大的成年心肌细胞，通常需要提取细胞核进行测序，但这会丢失大部分胞质mRNA信息。为了克服这一挑战，本研究采用了具有大孔径喷嘴的纳米孔单细胞筛选平台和成像系统，成功分离并测序了来自HFpEF小鼠心脏的完整活体心肌细胞和非心肌细胞。

关键技术方法概述

本研究整合了新生成的HFpEF小鼠模型和已发表的HFrEF小鼠模型（GEO: GSE120064）的单细胞RNA测序数据，构建了一个包含21,747个心脏细胞的综合图谱。研究团队通过Langendorff灌流法分离小鼠心室区的心肌细胞和非心肌细胞，并利用纳米孔单细胞筛选平台（ICELL8芯片）进行scRNA-seq。数据分析包括细胞类型注释、细胞间通讯分析（使用CellChat）、基因调控网络推断（使用SCENIC）、代谢活性分析（使用scMetabolism），并与心衰全基因组关联研究（GWAS）和表达数量性状位点（eQTL）数据进行整合，以探讨心衰亚型的遗传易感性。动物模型通过高脂饮食和L-NAME诱导模拟HFpEF的代谢和高血压应激。

研究结果

单细胞图谱概览

研究成功构建了一个包含21,747个小鼠心脏细胞的综合单细胞图谱，涵盖了HFpEF和HFrEF两种模型。图谱鉴定出9种主要细胞类型，包括心肌细胞（CMs, 49.7%）、成纤维细胞（FBs, 15.2%）、内皮细胞（ECs, 12.1%）、免疫细胞（巨噬细胞MPs、粒细胞GNs、T细胞、B细胞，共14.7%）以及心内膜细胞（EcCs, 1.9%）等。该细胞比例与人类心脏细胞研究的结果高度一致，证明了图谱的可靠性。

全局转录组差异

通过将单细胞数据按样本组（HFpEF、HFpEF对照、HFrEF、HFrEF对照）聚合并创建伪批量表达谱进行分析，发现HFpEF与对照相比有1,355个基因上调，636个基因下调。上调基因显著富集于横纹肌细胞发育和脂肪酸代谢过程。线粒体基因表达分析显示，HFpEF和HFrEF中线粒体基因的失调模式不同：HFpEF中13个线粒体基因显著失调，富集于脂质代谢、脂肪酸代谢和碳水化合物代谢通路；而HFrEF中15个线粒体基因失调，主要富集于氧化磷酸化（OXPHOS）和金属离子稳态通路，提示两种心衰亚型存在不同的线粒体适应机制。

心肌细胞是HFpEF中细胞通讯的主导枢纽

细胞间通讯分析揭示，在HFrEF中，成纤维细胞（FBs）作为信号来源细胞，其相互作用数量变化最显著（N=92），其分泌的配体（如胶原蛋白COL_LAGEN和纤维连接蛋白FN1）与胶原合成和细胞外基质组织相关。相反，在HFpEF中，心肌细胞（CMs）成为主导的通讯“枢纽”，表现出最高的差异上调相互作用数量（CM: 82）和相互作用强度（CM: 0.0193），表明CMs在HFpEF中高度互联，在信号传递和影响邻近细胞方面比其他细胞类型更为关键。CMs增强了VCAM、EPHA和HSPG信号通路的激活，提示HFpEF可能加剧慢性炎症。

HFpEF与HFrEF的心肌细胞亚型高度异质

对10,036个心肌细胞进行无监督聚类，鉴定出8个不同的亚群。其中CM1、CM2、CM4和CM5是两个心衰模型中共有的亚群。CM1富含编码肌节蛋白（如Ttn）和钙处理蛋白（如Ryr2）的基因，与收缩功能相关。CM2富含肌钙蛋白复合体（Tnni3）和线粒体呼吸链复合物成员（Ndufa4）基因，与能量代谢相关。CM4和CM5则分别高表达内皮细胞或成纤维细胞的标志物（如Pecam1, Cdh5或Dcn, Vim）。研究还鉴定出三个在HFrEF病理背景下特异性升高的亚群（CM6, CM7, CM8）。CM6可能与年龄依赖性心室肌细胞相关，高表达细胞因子和趋化因子信号基因（如Ccl2, Ccl4）。CM7高表达肌球蛋白基因Myh7和心肌病相关蛋白Xirp2，与心脏肌肉组织形态发生相关。CM8高表达心房钠尿肽前体编码基因Nppa，提示心脏肥大，并富集于干扰素信号通路，表明存在炎症异常。

特别值得注意的是，CM3是HFpEF中特异存在的亚群，其显著特征是高度表达烟酰胺核糖激酶2（Nmrk2）以及脂肪酸代谢相关基因（如Acaa2, Fabp3, Ech1）。免疫荧光验证证实Nmrk2和Acaa2在HFpEF心脏中的信号强度显著高于对照组和HFrEF组。单细胞代谢活性分析显示，CM3在脂肪酸相关代谢过程中的活性最高（平均活性值: 0.10），表明其脂质氧化能量消耗很高，这可能与HFpEF相关的代谢紊乱有关。

不同细胞类型的调控异质性

通过SCENIC分析基因调控网络，共鉴定出72个细胞类型典型调节子（cell-type typical regulons, TRs）。在心肌细胞中鉴定出的8个典型调节子中，有4个（Ppargc1a, Nfe2l1, Rxrg, Atf6）与代谢特征相关，另外3个（Mitf, E2f6, Hmgb3）与心肌肥大或炎症相关。例如，Ppargc1a（78g）是心肌细胞中第二高特异性评分（RSS）的调节子，其主要在CMs中表达，是线粒体能量和脂质代谢的关键调节因子。

不同模型间的调控异质性

研究进一步定义了HFpEF和HFrEF的亚型典型调节子（subtype TRs），分别为186个和79个。重点关注与脂质代谢和心脏收缩/舒张功能障碍（Lipid metabolism-Systolic & Diastolic dysfunction, LSD）相关的基因。在HFpEF的CMs中，有6个调节子活性升高，其中Atf6（157g）、Ppargc1a（78g）、Mitf（50g）和E2f6（4,759g）形成了一个转录调控网络：Atf6调控Ppargc1a和Mitf，后两者又相互调控。在HFrEF的CMs中，有4个调节子活性减弱（Rxrg（512g）、Ppargc1a（78g）、Mitf（50g）和Uqcrb（1,437g）），也形成了一个调控网络。值得注意的是，Ppargc1a（78g）和Mitf（50g）的二元活性在HFpEF和HFrEF的CMs中表现出相反的趋势，表明其受到不同上游转录因子的驱动。这些调节子均显著富集了LSD相关基因。在HFpEF特异的CM3亚群中，活性“开启”比例最高的调节子也都是LSD富集的调节子，其中Ppargc1a（78g）也是CM3的典型调节子，强烈提示HFpEF的CMs与活跃的脂质代谢及收缩/舒张功能障碍密切相关。

心衰相关位点、易感基因与代谢的综合分析

整合GWAS和scRNA-seq数据，从8项心衰GWAS研究中最终确定了与91个心衰相关位点对应的210个心衰易感基因。其中14个LSD富集的调节子显著富集在22个心衰相关位点中。通过筛选细胞类型典型基因（cell-type typical genes, TGs）和亚型典型基因（subtype typical genes, TGs）与心衰易感基因的交集，最终确定了8个心衰易感细胞类型典型基因和51个心衰易感亚型典型基因。例如，ACTN2是CMs中的细胞类型典型易感基因，其在人类心脏的CMs中表达水平最高。HFpEF以心衰易感亚型典型基因的升高为主（85.71%升高），而HFrEF则呈现相反趋势（80.00%减弱），表明两者表达模式显著不同。

共定位分析发现，6个心衰相关位点与心脏相关组织中的一个或多个eQTL共定位。例如，rs12724121是心脏心房附件组织中ACTN2（CMs中的细胞类型典型基因）的eQTL，其与心衰GWAS信号共定位（共享一个因果变异的后验概率PPH₄=99.90%），表明该位点可能通过调控ACTN2的表达影响心衰易感性。功能研究通过shRNA敲低H9C2心肌细胞中的Actn2，诱导了舒张功能障碍的典型分子变化（如Ryr2, Trpc1等上调），为ACTN2在舒张异常通路中的关键调控作用提供了功能证据。

研究结论与意义

本研究通过对HFpEF小鼠心脏进行单细胞测序，并结合公共HFrEF数据，全面表征了不同心衰亚型的转录谱和调控因子。研究首次揭示在HFpEF中，心肌细胞而非传统认为的内皮细胞或成纤维细胞是细胞间通讯的核心枢纽，并鉴定出HFpEF特异的心肌细胞亚群CM3，其特征是脂肪酸代谢异常活跃。调控网络分析揭示了HFpEF和HFrEF中截然不同的转录因子激活模式（如HFpEF中Atf6-Ppargc1a-Mitf网络的上调）。通过整合GWAS数据，研究还定位了心衰易感基因的细胞类型和亚型特异性功能，例如发现rs12724121可能通过调控CMs中的ACTN2表达影响HFpEF的进展。

这些发现深化了对HFpEF和HFrEF作为不同疾病实体的分子基础的理解。HFpEF的发病机制远不止内皮功能障碍和炎症，还深刻涉及脂肪酸代谢紊乱和特定转录因子的异常激活。靶向心肌细胞代谢，特别是脂肪酸代谢，以及调控关键转录因子（如Ppargc1a, Atf6），可能成为治疗HFpEF的新策略。本研究为未来开发针对特定心衰亚型和细胞类型的精准疗法提供了重要的理论依据和潜在的干预靶点。