密码子改变对基于PCR技术基因兴奋剂检测的挑战与高通量测序解决方案

本研究针对基因兴奋剂检测中qPCR技术因靶点密码子改变而漏检的难题，开发了人EPO基因标准品体系，通过qPCR与测序技术对比验证，证实密码子变异会显著干扰qPCR检测效率，为WADA规范提供重要技术参考，并倡导采用高通量测序构建更可靠的检测体系。

　　

随着基因操作技术（包括基因递送、基因编辑等）日益成熟，其在体育运动中作为基因兴奋剂的滥用风险引发广泛关注。世界反兴奋剂机构（WADA）明确禁止基因兴奋剂行为，并颁布了基于定量实时荧光PCR（qPCR）技术的检测指南。然而qPCR的技术特性使其难以应对新型兴奋剂靶标，且靶基因的密码子改变可能严重影响检测效率。

研究者通过制备人源EPO基因（hEPO）的基因组版和转基因版标准品，设计qPCR引物系统评估密码子变更对检测的影响。实验证实：精心设计的qPCR方案可有效捕获转基因信号，但密码子修改会严重削弱检测灵敏度。在模拟真实基因兴奋剂场景的混合样本测试中，qPCR能检测野生型基因，却无法识别经过密码子优化的转基因版本。

作为方法学验证，团队采用桑格测序进行比对，证明测序技术可准确捕获包括密码子修改在内的转基因序列。该研究揭示了密码子改变对qPCR法检测基因兴奋剂提出的重大挑战，呼吁未来建立基于高通量测序的无偏倚检测新范式。