Foxp3在调节性T细胞中的时空调控：从发育建立到功能维持的语境依赖性需求

《Nature Immunology》：Temporal and context-dependent requirements for the transcription factor Foxp3 expression in regulatory T cells

本研究通过新型化学遗传学技术实现Foxp3蛋白的可诱导降解，揭示了Foxp3在调节性T细胞(Treg)不同发育阶段和生理病理环境中的差异性需求。研究发现成熟Treg细胞在稳态下对Foxp3缺失表现出惊人韧性，而在新生期、增殖状态和肿瘤微环境中则高度依赖Foxp3。该研究为靶向Treg细胞的免疫治疗提供了新策略。

　　

在免疫学领域，调节性T细胞(T_reg)一直是科学家们关注的焦点。这些细胞作为免疫系统的"警察"，负责维持自身耐受和防止过度免疫反应。而Foxp3蛋白则是T_reg细胞的"身份证"，是它们发挥功能的关键转录因子。然而，长期以来，科学界对Foxp3的作用机制存在一个谜团：为什么有些情况下T_reg细胞失去Foxp3后会变成"坏警察"引发自身免疫病，而在另一些情况下它们却能保持功能？

这个问题困扰着免疫学家多年。传统的观点认为，Foxp3是T_reg细胞终身不可或缺的"指挥官"，但这一观点与临床观察存在矛盾。在严重的感染或自身免疫病中，T_reg细胞有时会失去Foxp3表达却不立即导致功能崩溃。这种矛盾促使研究人员思考：Foxp3在T_reg细胞的不同生命周期和不同环境中是否扮演着不同的角色？

为了解开这个谜题，Wei Hu等研究人员在《Nature Immunology》上发表了一项突破性研究。他们开发了一种创新的化学遗传学方法，能够在活体动物中精确控制Foxp3蛋白的降解时间点和持续时间，从而避免了传统基因敲除技术的局限性。

研究团队采用的关键技术方法包括：新型化学遗传学小鼠模型（基于植物来源的AID-TIR1系统）、单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术、流式细胞术分析、体外抑制实验、肿瘤模型以及染色质可及性测定(ATAC-seq)。这些技术的结合使得研究人员能够从多个维度全面解析Foxp3在T_reg细胞中的功能。

可诱导Foxp3蛋白降解系统的建立

研究人员首先构建了Foxp3^AID小鼠模型，该模型将植物来源的auxin-inducible degron (AID)序列与内源性Foxp3蛋白的N端融合。同时，他们通过CRISPR基因编辑技术对TIR1蛋白进行F74G突变，创建了ROSA26^TIR1(F74G)小鼠品系。这一改进的系统使用5-ph-IAA（5-phenyl-IAA）作为诱导剂，能够在6小时内实现近完全的Foxp3蛋白降解，且效果可持续至少24小时。

成熟T_reg细胞对Foxp3缺失的惊人韧性

在成年小鼠中连续进行Foxp3降解4周后，研究人员惊讶地发现，与完全清除T_reg细胞引起的致命自身免疫病不同，Foxp3降解仅导致轻微的免疫细胞活化，而没有出现明显的自身免疫病临床表现。脾脏和淋巴结的大小变化微小，组织病理学分析显示肝脏等器官几乎没有炎症浸润。

转录组水平的微小变化

通过单细胞RNA测序分析，研究人员发现Foxp3降解后，成熟T_reg细胞的整体转录组仅发生微小变化。在稳态条件下，只有32个基因上调和38个基因下调，这些基因很可能富含Foxp3的直接靶基因。特别值得注意的是，这些Foxp3降解敏感基因在静息态T_reg细胞中显著富集Foxp3结合位点，而在活化态T_reg细胞中则无此现象。

Foxp3降解敏感基因的特征

研究人员发现，Foxp3降解敏感基因具有明显的特征。被Foxp3激活的基因（如Il2ra、Lrrc32和Il2rb）附近含有丰富的Foxp3结合位点，且具有较高的H3K27Ac（组蛋白H3第27位赖氨酸乙酰化）和较低的H3K27me3（组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化）修饰水平。相反，被Foxp3抑制的基因（如Tcf7、Id2和Sox4）则显示相反的表观遗传特征。

发育阶段依赖性的Foxp3需求

与成年小鼠形成鲜明对比的是，新生小鼠中Foxp3降解导致严重的自身免疫病，类似于Foxp3完全缺陷小鼠的表现。转录组分析显示，新生小鼠T_reg细胞在Foxp3降解后出现数百个基因表达改变，远多于成年小鼠。胸腺中发育中的T_reg细胞对Foxp3缺失最为敏感，其次是静息态外周T_reg细胞，而活化态T_reg细胞的变化最小。

Tregassay.Bar graphs represent mean±s.e.m.Each point represents cells from a unique mouse.Data are pooled from two independent experiments and were analyzed using a two-tailed t-test.g.Experimental design of proliferating Tregcell analysis in vitro.Experiment consisted of five technical replicates per genotype.h,Volcano plots of DEGs from g separated by their presence among all up-or'>

增殖和炎症环境增强对Foxp3的依赖性

研究发现，增殖中的T_reg细胞对Foxp3降解更为敏感。在体外增殖实验中，高度分裂的细胞表现出更明显的表型变化。更重要的是，在严重炎症环境中，Foxp3缺失导致T_reg细胞适应性严重受损，转录组发生广泛改变。

肿瘤微环境中Foxp3降解的治疗潜力

在B16-OVA黑色素瘤模型中，Foxp3降解导致肿瘤迅速缩小，同时CD8⁺T细胞和NK（自然杀伤）细胞的效应功能增强。值得注意的是，这种治疗策略没有引起通常与全T_reg细胞清除相关的严重不良反应。肿瘤内T_reg细胞对Foxp3降解特别敏感，尤其是增殖中的细胞群体。

研究结论与意义

这项研究颠覆了人们对Foxp3在T_reg细胞中作用的传统认知。研究结果表明，Foxp3依赖的基因调控网络在T_reg细胞发育初期是脆弱且不稳定的，需要持续不断的Foxp3表达来建立和维持。然而，一旦这个网络完全成熟，它就获得了对Foxp3缺失的惊人韧性。

这种语境依赖性的Foxp3需求机制具有重要的理论意义和临床应用价值。理论上，它解释了为什么在不同生理病理条件下T_reg细胞对Foxp3缺失的反应存在巨大差异。临床上，这一发现为开发选择性靶向肿瘤内T_reg功能的免疫治疗策略提供了新思路，有望在增强抗肿瘤免疫的同时避免全身性自身免疫病的发生。

该研究还提出了一个"接力棒"模型来解释Foxp3的作用机制：Foxp3通过调控少数直接靶基因，这些基因再以反式作用方式影响下游间接靶基因，从而建立全基因组范围的转录调控网络。这种级联调控方式解释了为什么Foxp3依赖的转录程序需要较长时间才能完全建立，同时也说明了为什么成熟T_reg细胞在失去Foxp3后仍能保持大部分功能。

总之，这项研究不仅深化了我们对T_reg细胞生物学特性的理解，也为开发更安全、更有效的免疫治疗策略奠定了理论基础。特别是在肿瘤免疫治疗领域，针对Foxp3的语境依赖性靶向策略可能成为未来癌症治疗的重要方向。