自噬基因Atg16l1与内质网应激因子Xbp1协同保护转录相关诱变和小肠癌发生的作用机制研究

本研究针对炎症性肠病(IBD)患者小肠癌(SBA)风险增加的机制，通过构建条件性基因敲除小鼠模型(Rnaseh2bΔIEC)，揭示了Atg16l1介导的自噬和Xbp1调控的内质网稳态在DNA损伤应答中的协同作用。研究发现双缺陷型(Atg16l1/Xbp1/Rnaseh2bΔIEC)小鼠自发肠癌发生率高达95%，证实了自噬与ER应激通路交叉补偿在抑制肿瘤发生中的关键作用，为IBD相关癌变提供了新的分子框架和治疗靶点。

　　

在炎症性肠病(IBD)的研究领域，一个长期困扰科学家的问题在于：为什么克罗恩病患者的小肠癌发生率会显著升高？虽然慢性炎症被公认为癌症的驱动因素，但连接肠道炎症与恶性转化的精确分子机制始终笼罩在迷雾之中。更令人困惑的是，两个重要的IBD风险基因——自噬相关基因Atg16l1和内质网应激调控因子Xbp1，它们在维持肠道稳态中各自扮演重要角色，但二者是否以及如何协同参与癌症发生过程，仍是一个未解之谜。

这项发表于《Oncogene》的研究正是为了解开这个谜团。研究人员从临床观察出发，注意到70%的IBD相关小肠癌患者存在p53通路突变，而转录相关诱变（transcription-associated mutagenesis）被认为是导致基因组不稳定的关键机制。当细胞内的核糖核苷酸切除修复（RER）机制出现故障时，错误嵌入基因组的核糖核苷酸会引发TOP1介导的补偿性修复，从而导致插入-缺失突变（indel）的积累。团队前期研究已发现，肠道上皮特异性敲除Rnaseh2b（RER机制的关键酶）会诱发慢性DNA损伤和肠道炎症，但单纯RER缺陷并不足以引发癌症。

为了探究Atg16l1和Xbp1在其中的作用，研究团队构建了多种条件性基因敲除小鼠模型，包括单基因敲除(Atg16l1^ΔIEC、Xbp1^ΔIEC、Rnaseh2b^ΔIEC)、双基因敲除(Atg16l1/Rnaseh2b^ΔIEC、Xbp1/Rnaseh2b^ΔIEC)和三基因敲除(Atg16l1/Xbp1/Rnaseh2b^ΔIEC)小鼠。通过这些模型，他们系统研究了自噬和ER应激缺陷对DNA损伤应答、上皮增殖和肿瘤发生的影响。

在技术方法上，研究采用多学科交叉策略：利用Villin-Cre/loxP系统构建肠道上皮特异性基因敲除小鼠模型；通过免疫组化(γ-H2AX、TUNEL、Ki-67)分析DNA损伤、细胞死亡和增殖；使用小肠类器官(organoid)培养技术评估干细胞功能；通过RNA测序分析基因表达谱；采用Comet assay（彗星试验）定量检测DNA损伤程度；利用CRISPR/Cas9技术构建基因敲除细胞系；并通过Western blot和免疫荧光验证蛋白表达和定位。

Atg16/1 mediates DNA damage-induced autophagy in intestinal epithelial cells

研究人员首先在ModeK小肠上皮细胞系中发现，DNA损伤剂阿糖胞苷(AraC)处理可诱导自噬激活，表现为LC3-I/II转换增加和p62积累。通过siRNA敲低Atg16l1或CRISPR/Cas9敲除Atg16l1，他们证实Atg16l1是DNA损伤诱导的自噬所必需的。有趣的是，Atg16l1缺陷细胞在DNA损伤后表现出更严重的DNA断裂，提示Atg16l1介导的自噬在DNA损伤应答中起保护作用。

Atg16l1 critically coordinates the epithelial DNA damage response and suppresses epithelial proliferation

在体内实验中，Atg16l1/Rnaseh2b^ΔIEC双敲除小鼠表现出加剧的DNA损伤(γ-H2AX焦点增加)、上皮细胞死亡(TUNEL阳性细胞增多)和增殖抑制丧失(Ki-67阳性细胞增加)。类器官实验进一步证实，Atg16l1/Rnaseh2b^ΔIEC来源的类器官形成能力和大小均显著增加，表明自噬缺陷破坏了DNA损伤引发的增殖抑制。

Increased proliferation in aged Atg16I1/Rnaseh2b^ΔIEC mice did not lead to intestinal tumors

令人意外的是，尽管老年Atg16l1/Rnaseh2b^ΔIEC小鼠表现出持续的上皮增殖和DNA损伤，但它们并未自发形成肠道肿瘤。这与之前报道的Xbp1/Rnaseh2b^ΔIEC小鼠（61.7%肿瘤发生率）和Trp53/Rnaseh2b^ΔIEC小鼠的表型形成鲜明对比。

Atg16/1 deficiency did not impair p53 response to DNA damage

机制探讨表明，Atg16l1缺陷并不影响p53信号通路的激活。在AraC处理的ModeK细胞和小肠类器官中，Atg16l1敲除并未显著改变p53下游靶基因Ccng1、Mdm2和Ddit4l的表达水平。RNA测序数据也显示，Rnaseh2b^ΔIEC和Atg16l1/Rnaseh2b^ΔIEC类器官中p53通路基因表达谱相似。

Cooperative effects of ATG16L1 and XBP1 deficiency in promoting DNA damage response and proliferation

研究的关键发现出现在三敲除小鼠模型中。Atg16l1/Xbp1/Rnaseh2b^ΔIEC小鼠在年轻时期就表现出极其严重的DNA损伤、细胞死亡和上皮增殖。分子水平上，Atg16l1和Xbp1双缺陷的ModeK细胞和类器官显示p53应答基因（特别是Ddit4l）表达显著降低，提示两种缺陷协同抑制了p53介导的DNA损伤应答。

Atg16/1 deficiency fuels induction of intestinal adenocarcinoma

最重要的发现是：老年Atg16l1/Xbp1/Rnaseh2b^ΔIEC小鼠小肠癌发生率高达95%，显著高于Xbp1/Rnaseh2b^ΔIEC小鼠的61.7%。肿瘤多为腺癌，且与mTOR信号通路异常激活相关。免疫荧光分析揭示DNA损伤主要集中于隐窝基底部的lysozyme阴性干细胞区域，而在Paneth细胞(lysozyme阳性)中较少见。最后，研究人员证明mTOR抑制剂雷帕霉素可显著抑制Atg16l1/Xbp1/Rnaseh2b^ΔIEC类器官的生长，为靶向治疗提供了实验依据。

研究结论和讨论部分强调，这项工作首次揭示了自噬和ER应激通路在抑制转录相关诱变和肠道癌变中的协同作用。在分子机制上，Atg16l1和Xbp1通过交叉补偿机制维持肠道上皮基因组稳定性：当Xbp1缺陷导致ER应激应答受损时，Atg16l1介导的自噬可代偿性增强；反之亦然。只有当两个机制同时失效时，DNA损伤应答才会彻底崩溃，导致不可控的细胞增殖和癌变。

这项研究的重大意义在于为IBD相关小肠癌的发生提供了全新的分子框架：RNase H2功能缺陷导致的转录相关诱变是起点；p53通路功能障碍是允许恶性转化的关键步骤；而Atg16l1和Xbp1的共同缺陷则大大加速了这一进程。研究发现还解释了为什么具有ATG16L1 Thr300Ala多态性的克罗恩病患者在某些情况下预后反而较好——可能因为保留了自噬功能对ER应激的代偿能力。

从转化医学视角，这项研究不仅揭示了IBD患者小肠癌风险增加的机制，更重要的是指出了潜在的治疗靶点。mTOR信号通路的激活和Ddit4l的表达抑制可能是自噬和ER应激双重缺陷导致癌变的关键环节，而雷帕霉素对类器官生长的抑制效果为临床干预提供了实验依据。此外，研究建立的遗传学小鼠模型为后续筛选预防和治疗IBD相关小肠癌的药物提供了宝贵平台。

总之，这项工作通过精巧的实验设计、多层次的模型系统和深入的机制探讨，阐明了Atg16l1和Xbp1在维持肠道基因组稳定性中的协同作用，为理解炎症相关癌变提供了新范式，也为未来开发个体化防治策略奠定了理论基础。