新型姜黄素线粒体靶向纳米载体在肝癌小鼠模型中证实其靶向递送功效

《Scientific Reports》：Novel curcumin nanocarrier for targeting drug delivery of mitochondria proves efficacy in in vivo experiments on hepatocellular carcinoma mice models

本研究针对肝细胞癌(HCC)治疗中非选择性疗法系统毒性大的问题，开发了一种新型线粒体靶向姜黄素纳米载体(TDC)。研究人员通过修饰PAMAM G4树枝状聚合物与三苯基鏻(TPP)，成功构建了能够特异性靶向癌细胞线粒体的递送系统。体内实验表明，TDC能显著提高肿瘤组织中药物的蓄积，通过诱导ROS生成、调控凋亡相关基因表达(bax↑/p53↑、bcl2↓/p21↓/xiap↓)及促进细胞凋亡，有效抑制肝癌进展。该研究为基于天然化合物的靶向抗癌治疗提供了新策略。

　　

肝细胞癌(HCC)作为最常见的原发性肝癌，占所有肝癌病例的近90%，其治疗至今仍面临巨大挑战。手术、化疗和射频消融等常规手段主要着眼于缩小肿瘤体积，但往往在治疗结束后出现复发。更为棘手的是，现有化疗药物普遍存在严重的毒副作用，这主要源于它们缺乏对肿瘤细胞的特异性识别能力，在杀伤癌细胞的同时也对正常组织造成无差别攻击。面对这一困境，利用具有抗癌活性的天然植物化合物，并巧妙利用癌细胞与正常细胞之间细微的生理差异来设计靶向药物，成为了一条充满希望的途径。

在众多天然化合物中，从姜黄中提取的姜黄素(Curcumin)因其卓越的抗氧化、抗炎和抗癌特性而备受关注。作为一种类黄酮化合物，姜黄素相较于其他化疗药物具有副作用小的显著优点。其抗癌机制涉及与多种细胞信号通路的相互作用，从而诱导癌细胞凋亡、抑制其增殖、转移和血管生成。然而，姜黄素在生理环境中的疏水性极大地限制了其生物利用度和临床应用效果。另一个关键挑战在于如何将其有效地递送至细胞内的特定作用靶点。

近年来，越来越多的研究将癌症视为一种“线粒体代谢疾病”。线粒体作为细胞的“动力工厂”，在能量供应、代谢调节、氧化还原稳态调控和凋亡通路中扮演着核心角色。为了满足快速增殖和迁移的能量需求，肿瘤细胞会对其细胞活动进行重编程，这使得癌细胞内的线粒体通常更为活跃，并且其膜电位(ΔΨ_m)显著高于正常细胞。这种高膜电位特征为靶向治疗提供了理想的机会。如果能设计一种药物载体，利用癌细胞线粒体的高负电性膜电位作为“导航信号”，将药物高效富集到线粒体内，就有可能选择性地破坏癌细胞的能量代谢和凋亡平衡，从而产生更强的抗癌效果，同时减少对正常细胞的损伤。然而，姜黄素本身的疏水结构也阻碍了其穿过线粒体高度带负电的膜结构。

为了突破这些瓶颈，来自Tarbiat Modares大学的研究团队在《Scientific Reports》上发表了一项创新性研究。他们成功设计并合成了一种新型的线粒体靶向姜黄素纳米载体(TDC)。该载体的核心是第四代聚酰胺-胺树枝状聚合物(PAMAM G4)，这种聚合物具有精确的球形、纳米级的尺寸和高度支化的三维结构。PAMAM G4内部空腔能够有效包载疏水性药物姜黄素，显著提高其水溶性和稳定性。更重要的是，研究团队在树枝状聚合物的表面修饰了线粒体靶向分子——三苯基鏻(TPP)。TPP因其稳定的正电荷和三个苯环结构而具有极高的亲脂性，能够通过静电作用被带负电的线粒体膜强烈吸引，从而促进整个载体-药物复合物穿透线粒体膜并富集于线粒体基质中。这种巧妙的设计旨在实现姜黄素向癌细胞线粒体的高效、特异性递送。

为开展此项研究，研究人员主要运用了以下几项关键技术：首先合成了TDC纳米载体并进行了表征；随后利用Hepa1-6细胞构建了BALB/c小鼠肝癌模型；通过体内外实验评估了TDC的靶向性、抗肿瘤效果及免疫调节作用；采用流式细胞术、ELISA、qPCR及多种线粒体功能指标检测(如ROS、GSH、MDA、MMP、ATP)等手段深入探究了其作用机制；最后通过活体成像技术分析了药物的体内分布情况。

Curcumin nano carrier synthesis and characterization

研究人员成功合成了TDC纳米载体。表征结果显示，TDC纳米颗粒呈球形，平均流体动力学尺寸为61.2±7.2 nm，多分散指数(PDI)为0.25，表明颗粒分布较为均一。与未修饰TPP的载体(DC)相比，TDC的zeta电位由2.9 mV转变为正值，这证实了TPP成功连接到了树枝状聚合物表面。核磁共振氢谱(1H NMR)也显示了TPP芳环质子的特征峰(7-8 ppm)，进一步验证了TPP的成功连接。

H& E staining and tumor size measurement

在肝癌模型小鼠中的体内实验表明，TDC治疗能显著减小皮下移植瘤的体积。此外，组织学检查(H&E染色)证实了Hepa1-6细胞在肝脏、肺和脑部形成了转移灶，而TDC治疗显示了抑制这些转移的潜力。

Effect of the curcumin nano carrier on the viability of the cells and the isolated mitochondria

细胞毒性实验(MTT法)显示，TDC对肝癌细胞Hepa1-6表现出显著的毒性作用，且其效果优于游离姜黄素(FC)和非靶向的树枝状聚合物-姜黄素复合物(DC)。特别值得注意的是，在浓度高于25μM时，TDC对癌细胞的毒性选择性增强，其对癌细胞的半抑制浓度(IC₅₀)与对正常细胞(小鼠成纤维细胞)的IC₅₀比值(选择性指数SI)约为2.1，高于DC(1.5)和FC(1.2)，表明TDC具有更好的癌细胞选择性。从分离自肝细胞的线粒体活力测定结果来看，浓度高于35μM的姜黄素 formulations 能显著影响线粒体活力，且TDC的作用最为明显。

Cytokine assays in spleen cell culture

免疫反应分析显示，与未治疗的肿瘤模型组相比，经TDC、DC和FC治疗的肿瘤小鼠，其脾细胞在肿瘤抗原刺激下，干扰素-γ(IFN-γ)的分泌量显著升高，而白细胞介素-4(IL-4)的分泌量则降低。这种变化趋势表现为TDC > DC > FC，即TDC最能促进Th1型免疫反应(利于抗肿瘤)，同时抑制Th2型反应(可能与肿瘤免疫逃逸相关)。

Effect of TDC on the hepatocytes cell cycle and apoptosis

流式细胞术分析表明，所有姜黄素制剂均能增加细胞周期中Sub G1期的细胞比例(提示细胞凋亡)，且在肿瘤阳性小鼠中这一效应远高于健康小鼠。其中，TDC的作用最为显著。凋亡检测(Annexin V/PI双染)进一步证实，TDC在肿瘤阳性小鼠中诱导的凋亡率最高(约40-50%)，显著高于FC和DC。计算肿瘤阳性小鼠与健康小鼠的凋亡率比值发现，TDC组约为3.1，高于FC(2.4)和DC(2.6)，再次证明了TDC对肿瘤细胞具有优越的选择性杀伤作用。

ROS flow cytometry analysis in the isolated hepatocytes

分离的肝细胞内活性氧(ROS)水平检测显示，所有姜黄素治疗均能提高肿瘤模型小鼠肝细胞内的ROS水平，且TDC的效应最强。在健康小鼠中，ROS升高幅度较小，且TDC引起的升高具有高度显著性(P<0.0001)。

Viability assay of the mitochondria following curcumin treatments

对从肝组织和脑组织分离的线粒体进行MTT活力测定发现，TDC对肿瘤小鼠肝脏线粒体活力的抑制效果最强(活力下降近50%)，而对健康小鼠脑组织线粒体的影响甚微。这种差异可能源于血脑屏障(BBB)的完整性——健康状态下BBB阻止了纳米载体大量入脑，而肿瘤模型小鼠可能存在BBB破坏，使得TDC能更有效地进入脑组织并作用于转移灶的线粒体。

Effect of TDC on the mitochondrial ROS

在线粒体水平直接检测ROS发现，TDC能显著提升肿瘤小鼠肝脏和脑组织线粒体的ROS水平，其效果优于DC和FC。

Reduction of mitochondrial glutathione(GSH) by TDC

线粒体谷胱甘肽(GSH)含量测定表明，TDC能特异性降低肿瘤小鼠肝脏线粒体的GSH水平，而在健康小鼠中此效应不显著甚至相反(FC和DC表现出一定的提升作用，可能与姜黄素对正常细胞的保护效应有关)。GSH的耗竭会加剧氧化应激，促进凋亡。

ROS induction leads to lipid peroxidation in cancer cells

丙二醛(MDA)是脂质过氧化的标志物。TDC处理显著提高了肿瘤小鼠肝脏和脑组织线粒体的MDA含量，尤其在脑转移灶中升高超过50%，表明TDC引发了强烈的氧化损伤。

Elevation of the mitochondrial membrane potential(MMP)

线粒体膜电位(MMP)检测采用罗丹明123染料。结果显示，所有姜黄素制剂均能引起MMP去极化(膜电位降低)，且TDC的作用最显著。MMP崩溃是细胞凋亡早期的关键事件。

Elevation of the mitochondrial ATP by TDC

线粒体ATP含量测定发现，TDC处理使肿瘤小鼠肝脏线粒体ATP含量大幅增加(约220%)。凋亡是一个耗能过程，早期ATP水平的维持对于凋亡程序的执行至关重要，此结果支持TDC主要通过诱导凋亡而非坏死来杀伤癌细胞。

Expression changes of cancer-related genes by curcumin treatments

qPCR分析显示，TDC能显著上调促凋亡基因bax和p53的表达，同时下调抗凋亡基因bcl2、p21和xiap的表达。这种基因表达谱的变化在肿瘤组织中尤为明显，且TDC的调控作用最强，清晰地揭示了其诱导癌细胞凋亡的分子机制。

Biodistribution analysis& safety assessment ofTDC

活体荧光成像显示，与FC相比，TDC在肿瘤组织和肝脏中的蓄积显著增加。同时，在整个实验期间，TDC治疗组小鼠未出现明显的体重下降或毒性症状，表明其具有良好的体内耐受性。生存分析进一步显示，TDC能显著延长荷瘤小鼠的中位生存期。

本研究成功开发并验证了一种新型线粒体靶向姜黄素纳米递送系统(TDC)。综合各项实验结果，TDC展现出显著优于游离姜黄素和非靶向纳米载体的抗肝癌效果。其核心优势在于利用TPP对线粒体的天然靶向性，实现了姜黄素在癌细胞线粒体内的特异性富集。TDC通过诱导线粒体氧化应激(升高ROS、MDA，耗竭GSH)、破坏线粒体膜电位、激活线粒体凋亡通路(调控bax/bcl2、p53等基因表达)以及调节机体抗肿瘤免疫反应(促进IFN-γ、抑制IL-4)等多重机制，选择性诱导肝癌细胞凋亡，并有效抑制肿瘤生长和转移。值得注意的是，TDC对正常组织的影响相对较小，体现了其良好的靶向性和安全性。该研究不仅为克服姜黄素临床应用障碍提供了创新性解决方案，也为基于天然产物的线粒体靶向抗癌策略奠定了坚实的实验基础，对于开发高效低毒的肝癌治疗新方法具有重要的科学意义和转化前景。