快速超声辅助整体组织透明化与免疫染色技术（SoniC/S）的开发及其在三维高分辨率成像中的应用

《Scientific Reports》：Rapid sonication-assisted whole tissue clearing and immunostaining

本研究针对生物组织三维结构高分辨率成像中存在的组织光学异质性、传统透明化方法耗时过长（48小时至32天）及荧光探针扩散深度不足等瓶颈问题，开发了一种创新的超声辅助组织透明化与免疫荧光染色方法（SoniC/S）。该方法通过将低频超声（40 kHz）与商用化学透明化试剂盒（PEGASOS）及iDISCO染色技术相结合，在小鼠肌肉、大鼠肌腱和小鼠脾脏等多种组织中实现了36小时内完成透明化、15小时内实现均匀标记，显著提升了成像效率与深度，为生物医学研究提供了快速、高效的体积成像解决方案。

　　

在生物医学研究中，高分辨率地揭示组织内部的三维结构对于理解疾病机制、细胞相互作用及信号传导路径至关重要。然而，生物组织本身的光学异质性——不同组分间折射率（RI）的差异及内源性色素（如血红素）对光的吸收——导致光散射和衰减，使得深层成像困难重重。传统的组织透明化技术虽能提升组织透明度，但耗时极长，例如PEGASOS方法处理大鼠脾脏需14天，而灌注辅助或电场辅助方法虽能加速过程，却可能引起组织变形或分子损伤。更棘手的是，抗体等大分子在致密胶原组织（如肌腱）或富含色素组织（如脾脏）中的渗透效率极低，往往只能标记样本表层，无法实现整体均匀成像。

针对这些挑战，香港中文大学王丹团队在《Scientific Reports》上发表了一项创新研究，开发了名为SoniC/S（Sonication-Assisted Tissue Clearing and Immunofluorescent Staining）的技术。该方法将低频超声（LFU）与商用PEGASOS透明化试剂盒及iDISCO染色流程相结合，通过超声产生的空化效应和声孔作用，显著加速试剂渗透和抗体扩散，从而在极短时间内实现高质量的整体组织透明化和深层免疫标记。

研究团队首先评估了低频超声对组织完整性的影响。通过将小鼠胫骨前肌（TA）、大鼠跟腱和小鼠脾脏分别置于被动浸泡、温和振荡及40 kHz超声处理环境中，发现即使持续168小时，超声引起的组织变形和蛋白流失与对照组无显著差异，且优于传统振荡法，证明低频超声在安全范围内可有效增强分子渗透性。

基于此，团队开发了SoniClear透明化方案，通过将PEGASOS试剂步骤与超声处理结合，将总处理时间从216小时大幅缩短至6-72小时。在鼠标TA肌肉中，SoniClear-2和SoniClear-3方案的光透过率在400-1000 nm波长范围内均优于传统PEGASOS方法，例如在600 nm处，PEGASOS透光率为76.56%，而SoniClear-3达87.94%。组织透明度量化显示，SoniClear-3处理的肌肉透明度为35.05线对/毫米，显著高于PEGASOS的18.67线对/毫米。

对于致密胶原组织如大鼠跟腱，SoniClear同样表现出色。SoniClear-3方案使肌腱在36小时内实现透明，光透过率在800 nm处达86.85%，远高于PEGASOS的66.95%。而在富含色素的小鼠脾脏中，SoniClear-3方案仅用36小时即达到30.26线对/毫米的透明度，优于传统方法且组织收缩更小。

在免疫染色方面，团队开发了SoniCStain方案，将超声引入抗体孵育步骤。与传统被动浸泡法（192小时）相比，SoniCStain仅需5-15小时即可在大鼠跟腱中实现深达1000 μm的均匀标记，且Hoechst核信号和胶原I型（Col I）抗体在组织内部的荧光强度显著提高，避免了边缘累积效应。

该研究的核心技术创新在于将低频超声的物理效应与化学透明化、免疫染色流程有机结合，通过声孔效应和空化作用打破了传统扩散限制，在保证组织形态和蛋白保留的前提下，极大提升了处理效率。SoniC/S技术不仅适用于软组织、致密胶原组织和色素丰富组织，还为多标成像、疾病模型研究及临床样本快速分析提供了新工具。未来，该技术有望与多光子成像、人工智能重建等前沿技术结合，进一步推动组织三维解析在精准医学中的应用。