检查点激酶Mec1p通过调控鱼雷核酸外切酶Rat1p和招募Pcf11p在转录终止中的新功能

本研究发现酵母检查点激酶Mec1p在无外源基因毒性应激条件下，通过双重机制调控转录终止：一方面促进剪切因子IA亚基Pcf11p的招募，另一方面负向调控鱼雷核酸外切酶Rat1p的活性。该研究揭示了DNA损伤应答与转录终止之间的新型互作机制，为理解检查点激酶在RNA代谢中的非经典功能提供了重要见解。

　　

在真核生物中，RNA聚合酶II（RNAPII）的转录循环需要经历 initiation（起始）、elongation（延伸）和termination（终止）三个精密调控的阶段。其中，转录终止过程与pre-mRNA 3'端加工紧密偶联，负责将RNAPII从DNA模板上解离并释放新生的RNA转录本。高效的终止机制对于维持可重新进入新一轮转录循环的RNAPII池至关重要。近年来研究发现，转录终止缺陷会引发基因组不稳定并激活DNA损伤应答（DDR），而DDR信号又能够反向全局抑制转录终止过程，表明这两个核心细胞过程存在深刻的相互调控关系。

作为DDR信号通路中的核心传感器激酶，Mec1p（在哺乳动物中为ATR的同源物）通常在应对基因毒性应激时被激活。然而有趣的是，最近有证据表明即使在没有外源DNA损伤的情况下，Mec1p的失活也会下调转录终止效率并降低pre-mRNA在polyadenylation（pA）位点的剪切效率，暗示Mec1p可能具有超越经典DDR功能的新角色。为了深入解析Mec1p在转录终止中的具体作用机制，研究人员在《Scientific Reports》上发表了这项系统性研究。

研究团队主要运用了实时定量RT-PCR分析转录本加工效率、染色质免疫沉淀（ChIP）技术检测蛋白在基因位点的 occupancy、Western blotting分析蛋白表达水平以及遗传互作分析等方法。

Mec1p是招募Pcf11p到PMA1和PYK1基因3'末端所必需的

通过ChIP实验发现，在mec1△sml1△细胞中，CF IA复合物的支架亚基Pcf11p在PMA1和PYK1基因3'末端的占据显著降低。值得注意的是，这种招募缺陷并非由于CTD Ser2磷酸化水平的变化引起，因为mec1△sml1△细胞中Ser2-P水平和Ser2-P/total RNAPII比值反而略有升高。Western blot分析进一步排除了Pcf11p蛋白表达量变化的可能性，表明Mec1p特异性影响Pcf11p的招募过程而非其稳定性。

MEC1失活抑制PCF11和RNA14低表达细胞的生长缺陷和pre-mRNA加工缺陷

令人意外的是，当研究人员在PCF11、RNA14、RNA15和YSH1表达受 tetO7 启动子调控的菌株中引入mec1△sml1△突变后，发现Mec1p失活反而能够抑制tetO7-PCF11细胞的生长缺陷。通过测量PMA1和PYK1 pre-mRNA在pA位点的剪切效率发现，tetO7-RNA14和tetO7-RNA15细胞中pre-mRNA剪切和pA位点下游RNA降解的缺陷同样被Mec1p失活所抑制。这表明Mec1p失活可能促进了某种能够支持pA位点剪切和下游RNA降解的蛋白的招募和/或活性。

MEC1失活抑制PCF11或RNA14低表达细胞的转录终止缺陷

RNAPII占据分析显示，tetO7-PCF11和tetO7-RNA14细胞的转录终止效率显著降低，表现为3'-UTR区RNAPII占据增加。重要的是，Mec1p失活能够抑制这两种细胞中的转录终止缺陷。这一发现表明Pcf11p的两个功能——pA位点剪切和转录终止——在分子水平上是可以分离的，且Mec1p失活可能通过影响CF IA和CPF复合物招募后的步骤来抑制终止缺陷。

MEC1失活不抑制pcf11-2和pcf11-9细胞的转录终止缺陷

与可调控的tetO7-PCF11系统不同，当研究人员在含有pcf11-2和pcf11-9点突变的菌株中引入mec1△sml1△突变时，发现Mec1p失活并不能抑制这些细胞的转录终止缺陷。由于pcf11-2和pcf11-9突变破坏了Pcf11p与Rat1p的相互作用并损害Rat1p向pA位点的招募，这一结果提示Mec1p失活的 suppression 效应可能需要完整的Pcf11p-Rat1p相互作用。

MEC1失活抑制rat1-1细胞的pre-mRNA加工和转录终止缺陷

为了直接验证Mec1p是否通过调控Rat1p来影响转录终止，研究人员在rat1-1突变体中引入mec1△sml1△突变。结果显示，rat1-1细胞在pA位点剪切和下游RNA降解方面的缺陷被Mec1p失活显著抑制。相应地，rat1-1细胞的转录终止缺陷也在mec1△sml1△rat1-1细胞中得到 suppression。这些结果强有力地表明Mec1p通过负向调控Rat1p的功能来影响转录终止。

MEC1失活抑制rat1-1细胞的核糖体RNA和snoRNA加工缺陷

除了转录终止，Rat1p还参与rRNA和snoRNA的加工过程。研究发现，rat1-1xrn1△细胞中未加工的5.8S和25S rRNA以及pre-snR190的积累在mec1△sml1△rat1-1xrn1△细胞中被显著抑制。这一发现表明Mec1p影响的 Rat1p功能特征是其rRNA和snoRNA加工与转录终止所共通的，而非特异性针对RNAPII转录终止机制。

MEC1失活不促进Rat1p和Rat1-1p向PMA1和PYK13'末端的招募

ChIP分析显示，与野生型细胞相比，mec1△sml1△细胞中Rat1p在PMA1和PYK1基因体和pA位点下游的占据显著降低。重要的是，Mec1p失活并未提高Rat1-1p在pA位点下游的占据，表明 suppression 效应并非通过增加Rat1-1p的招募实现，而可能是通过增强Rat1-1p的活性或改善其功能状态。

rat1-1细胞转录终止和核糖体RNA及snoRNA加工缺陷的抑制需要Mec1p的激活

通过引入rad17△、rad24△和rad9△等破坏Mec1p激活的突变，研究人员发现这些突变同样能够抑制rat1-1xrn1△细胞的rRNA和snoRNA加工缺陷以及rat1-1细胞的转录终止缺陷。这表明Mec1p的激酶活性（而非单纯蛋白存在）是下调Rat1p功能所必需的，且经典的9-1-1复合物介导的Mec1p激活通路参与这一调控过程。

本研究系统阐明了检查点激酶Mec1p在转录终止中的双重作用机制：一方面通过促进CF IA亚基Pcf11p向基因3'末端的招募正调控终止过程，另一方面又通过其激酶活性负向调控鱼雷核酸外切酶Rat1p的功能。这种看似矛盾的调控模式可能反映了细胞在正常生长条件下对转录终止过程的精细平衡需求。尤为重要的是，Mec1p对Rat1p的调控不仅影响mRNA的转录终止，还延伸至rRNA和snoRNA的加工过程，表明这是一种全局性的RNA代谢调控机制。

从更广阔的视角来看，这项研究揭示了DNA损伤应答核心元件与基础转录机器之间存在前所未有的直接联系，为理解细胞如何在维持基因组稳定性和高效基因表达之间实现平衡提供了新见解。Mec1p对Rat1p功能的负调控可能代表一种反馈机制，在S期结束时帮助下调Mec1p信号活性，从而确保细胞周期进程的正常进行。这些发现不仅深化了我们对转录终止机制的理解，也为探索检查点激酶在RNA代谢中的非经典功能开辟了新的研究方向。