靶向BRAFV600E的氧代四氢嘧啶-苯磺酰胺杂合分子：理性设计、合成、动力学模拟与抗癌活性评估

本研究针对BRAFV600E突变癌症治疗中存在的耐药性和 paradoxical activation 等问题，通过理性设计合成了一系列新型氧代四氢嘧啶-苯磺酰胺杂合分子。研究人员采用分子对接、300 ns分子动力学模拟和MM/GBSA结合自由能计算等技术，结合体外抗癌活性评价，发现化合物S4对BRAFV600E激酶抑制率达91.2%，其结合模式稳定（ΔGbind=-18.1 kcal·mol-1），为开发新型BRAF抑制剂提供了先导化合物。

　　

在癌症治疗领域，BRAF基因突变一直是科学家们关注的焦点。特别是在黑色素瘤、甲状腺癌等恶性肿瘤中，BRAF^V600E突变体的异常激活会导致MAPK信号通路持续活化，促进肿瘤细胞的无限增殖和转移。虽然目前已有索拉非尼(sorafenib)、维莫非尼(vemurafenib)等FDA批准的BRAF抑制剂应用于临床，但这些药物存在一个令人困扰的问题——paradoxical activation（ paradoxical activation，即药物在抑制突变型BRAF的同时，意外激活野生型BRAF的二聚化，进而促进肿瘤生长）。此外，耐药性的出现以及药物引起的皮肤鳞状细胞癌等副作用，都迫切需要开发新一代的BRAF抑制剂。

为了解决这些难题，来自印度中央旁遮普大学、沙特阿卜杜拉国王科技大学等研究机构的研究人员开展了一项创新性研究。他们巧妙地设计了一类新型氧代四氢嘧啶-苯磺酰胺杂合分子，这些化合物靶向BRAF^V600E激酶的特定构象状态（αC-OUT/DFG-IN），类似于第二代FDA批准药物的作用机制。该研究成果近期发表在《Scientific Reports》上，为开发更有效、更安全的BRAF抑制剂提供了重要线索。

研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先通过合理的药物设计策略，基于FDA已批准BRAF抑制剂的药效团特征，设计了9个新型杂合分子（S1-S9）；采用多步有机合成方法（包括磺酰化、Claisen-Schmidt缩合和Michael加成环化反应）合成目标化合物，并通过质谱、核磁共振氢谱和碳谱进行结构确证；利用AutoDock Vina进行分子对接研究，筛选出与BRAF^V600E（PDB ID: 5JRQ）结合能力最佳的化合物；对最具潜力的化合物进行300 ns分子动力学模拟，评估复合物稳定性（RMSD、Rg、SASA、RMSF等参数）；采用MM/GBSA方法计算结合自由能，并通过残基分解分析识别关键相互作用位点；通过MTT法测定化合物对A375（人恶性黑色素瘤）和TPC-1（甲状腺癌）细胞系的抗增殖活性；使用BRAF^V600E激酶检测试剂盒测定化合物的激酶抑制活性。

理性设计

研究团队基于第一代和第二代FDA批准的BRAF抑制剂的结构特征，进行了精心的理性设计。他们发现设计的化合物能够与ATP结合口袋的活性核心区域产生结合亲和力。其中，R-取代的磺酰胺部分与RAF选择性口袋相互作用，苯环与疏水口袋结合，嘧啶环与核糖口袋结合，R1-取代基与腺嘌呤口袋相互作用，而羰基（C=O）则延伸到ATP结合口袋以外的溶剂可及区域。开发的嘧啶-磺酰胺杂合分子表现出与FDA批准的BRAF^V600E抑制剂相似的[αC-OUT/DFG-IN]构象，设计的化合物与二聚化界面（DIF）相互作用，这使得它们成为对抗BRAF^V600E耐药和由二聚BRAF突变体引起的恶性肿瘤的潜在有价值药物。

分子对接和分子动力学模拟

研究人员对9个合成化合物和参考药物索拉非尼针对BRAF^V600E蛋白进行了分子对接研究。体外激酶测定显示，测试化合物的抑制活性范围在65%到94%之间。化合物S4（91%）和S1（87%）表现出最强的抑制效果，与参考药物索拉非尼（94%）相当。基于这些有希望的结果，选择化合物S4和S1进行后续的分子动力学模拟，以全面研究它们在BRAF^V600E活性位点内的结合稳定性和构象动力学。

通过300 ns分子动力学模拟评估了蛋白质-配体复合物的稳定性。RMSD分析表明，BRAF:S1复合物在约10-20 ns的初始平衡阶段后稳定在2 ?左右，所有三个重复都显示出相似的趋势，具有轻微的波动，表明BRAF:S1复合物在整个模拟过程中保持相对稳定的构象。BRAF:S4复合物显示出最高的可变性，RMSD经常超过2.5 ?。BRAF:SOR复合物显示出中间稳定性，RMSD值稳定在2-2.5 ?之间。半径 of gyration（Rg）和溶剂可及表面积（SASA）分析进一步证实了所有三个蛋白质-配体复合物都保持稳定的三级结构。

氢键分析显示，BRAF:S4复合物表现出最高的平均氢键数（1.83），表明配体与结合位点之间存在强大而频繁的相互作用。蛋白质-配体指纹图谱提供了详细的相互作用时间分布，显示疏水接触、氢键供体和受体、范德华力接触以及π-π或π-阳离子堆叠等关键相互作用类型。对于BRAF:S4复合物，Ser535和Glu611等残基的氢键供体和受体是间歇性的，表明氢键的动态交换。Leu505、Val471和Phe610等残基在整个模拟过程中表现出持续的疏水相互作用，表明它们在维持配体在结合位点内稳定定位方面的关键作用。

结合自由能计算

使用MM/GBSA方法评估了S1、S4和SOR与BRAF蛋白的结合亲和力。S4表现出最有利的结合亲和力（ΔG_bind = -18.1 ± 5.3 kcal mol^-1），其次是S1（-15.9 ± 4.1 kcal mol^-1）和SOR（-14.6 ± 5.6 kcal mol^-1）。范德华相互作用（ΔE_vdw）是所有配体结合的主要贡献者，S4显示出最显著的贡献（-59.0 ± 4.0 kcal mol^-1）。熵贡献（TΔS）对所有配体都是不利的，反映了结合时构象自由度的减少。尽管存在显著的溶剂化和熵损失，S4由于其巨大的有利范德华和静电相互作用而成为最有效的结合剂。

每个残基的自由能分解分析突出了对配体S1、S4和SOR与BRAF蛋白结合做出贡献的关键残基。在所有配体中，Phe583始终表现出最有利的贡献，通过范德华力、疏水和偶尔的π-π堆叠相互作用稳定配体。对于S1，Trp531和Ile463是关键，还有Cys532和Val471，表明存在π-π堆叠、疏水接触和氢键的混合。对于S4，Thr529、Cys532和Val471很突出。就SOR而言，Ile463、Val471和Leu514值得注意，His539成为一个独特的贡献者。

药理活性测定

抗增殖试验

新合成的氧代四氢嘧啶-苯磺酰胺衍生物（S1-S9）的细胞毒性使用MTT法针对A375（人恶性黑色素瘤）和TPC-1（甲状腺癌）细胞系进行了评估。针对A375细胞系，合成衍生物的IC₅₀值范围从7.14 ± 0.18 μM到9.75 ± 0.16 μM，而参考药物索拉非尼的IC₅₀为0.80 ± 0.22 μM。针对TPC-1细胞系，合成衍生物的IC₅₀值范围从6.45 ± 0.28 μM到9.39 ± 0.30 μM，而索拉非尼的IC₅₀为0.62 ± 0.22 μM。大多数化合物表现出有效的抗肿瘤活性，IC₅₀值低于10 μM。

BRAF^V600E酶激酶测定

所有目标化合物都在体外检测了它们抑制BRAF^V600E激酶的能力。所有测试的化合物都成功抑制了BRAF^V600E酶的激酶活性，在500 nM纳摩尔水平上的抑制百分比与参考药物索拉非尼相当。在筛选的化合物中，化合物S4被揭示为优秀的BRAF^V600E抑制剂。索拉非尼具有94.81%的BRAF^V600E抑制活性；与索拉非尼相比，化合物S4具有91.20%的BRAF^V600E抑制活性。化合物S1和S9分别显示出87.27%和83.69%的BRAF^V600E抑制活性，接近索拉非尼。

氧代四氢嘧啶-苯磺酰胺杂合物的SAR

基于计算和药理学测定，如针对两种癌细胞系的抗增殖活性和BRAF^V600E激酶抑制，总结了一个通用的结构-活性关系（SAR）。合成的化合物在ATP结合口袋的活性核心区域内表现出结合亲和力。具体来说，R-取代的磺酰胺部分与RAF选择性口袋相互作用，苯环占据疏水口袋，嘧啶环与核糖口袋相互作用，R1-取代靶向腺嘌呤口袋，羰基（C=O）延伸到ATP结合位点以外的溶剂可及区域。在合成的化合物中，4-氯衍生物（S1）对BRAF^V600E激酶表现出有效的抗增殖活性。4-溴衍生物（S2）对A375和TPC-1细胞系表现出相当的抗增殖活性。类似地，2-硝基（S4）和4-硝基（S5）衍生物对A375细胞系显示出显著的活性。2,4-二氯衍生物（S7）也对A375和TPC-1细胞系表现出有效的抗增殖作用，而2-硝基衍生物（S9）显示出显著的BRAF^V600E激酶抑制活性。相比之下，如2,4-二氯（S3）、4-氯（S6）和4-硝基（S8）衍生物等化合物表现出较低的抗增殖和BRAF^V600E激酶抑制活性。

研究结论与意义

这项研究成功地设计、合成并评估了一系列新型氧代四氢嘧啶-苯磺酰胺杂合分子作为潜在的BRAF^V600E抑制剂。在这些化合物中，计算研究显示七个化合物表现出优于或与参考药物索拉非尼相当的对接分数。MM/GBSA结合自由能计算，以及RMSD、RMSF和SASA分析，全面揭示了这些配体在BRAF蛋白结合口袋内的结合动力学。

化合物S1表现出强大的结合亲和力和比其他候选物更高的稳定性，这由有利的结合自由能值以及较低的RMSD和RMSF值所表明。相比之下，化合物S4显示出比索拉非尼更高的RMSD但更低的RMSF值，表明其独特的结合行为。这些见解对于指导BRAF抑制剂的合理设计至关重要。

值得注意的是，化合物S4在测试的化合物中表现出最有效的BRAF^V600E激酶抑制活性。这些发现突出了吸电子取代基对抗癌活性的关键影响。总体而言，大多数合成的衍生物显示出有希望的抗癌潜力，S4及其相关类似物可以被视为BRAF^V600E抑制的潜在先导化合物。

该研究的创新之处在于：首次报道了这类氧代四氢嘧啶-苯磺酰胺杂合分子作为BRAF^V600E抑制剂；通过详细的分子动力学模拟揭示了化合物与靶点的相互作用机制；发现了化合物S4具有与索拉非尼相当的激酶抑制活性但可能具有更好的选择性；为克服现有BRAF抑制剂的 paradoxical activation 问题提供了新思路。

这项研究不仅为开发新型BRAF^V600E抑制剂提供了有价值的先导化合物，而且通过综合运用计算化学、分子模拟和实验验证的方法，为基于结构的药物设计提供了重要参考。未来研究可以进一步优化这类化合物的药代动力学性质，开展更深入的体内药效学评价，并探索其与其他靶向药物的联合用药策略，为BRAF突变相关癌症的治疗提供更多选择。